副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究与环介导恒温扩增法的建立

【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,给养猪业造成巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌至少有15个血清型。根据猪健康状况和菌株毒力的高低,感染后可以造成急性或者慢性的感染。副猪嗜血杆菌感染尤其对早期断奶的仔猪造成较大的危害。 副猪嗜血杆菌的感染可通过疫苗接种和抗生素治疗所控制。但是,对于疾病控制的基础是能够准确的诊断出致病病原。采用细菌分离的方法来鉴定副猪嗜血杆菌存在几个缺陷,一方面是副猪嗜血杆菌对生长条件的要求较高；另一方面是,病猪可能接受过抗生素治疗。因此,许多分子诊断方法已被研究和应用。在这些检测方法中,基于PCR技术的诊断方法能够快速、灵敏的检测出副猪嗜血杆菌。但是,在PCR扩增过程中需要用到的具备精密的热循环功能的仪器仍然妨碍PCR技术的广泛应用。环介导的恒温扩增法是一种新的恒温、高效的核酸扩增法。在本研究中,我们以副猪嗜血杆菌高度保守的16S rRNA基因为靶基因,建立了检测副猪嗜血杆菌的环介导恒温扩增法。 天然免疫应答是脊椎动物对抗入侵的外界微生物的第一道防线。天然免疫细胞主要包括中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等。作为宿主天然免疫细胞的重要一员,巨噬细胞通过直接清除微生物和释放相应的细胞因子和趋化因子来聚集其它的免疫细胞到感染部位来发挥其免疫学功能。病原菌要在宿主体内存活和繁殖,必须要突破宿主的免疫屏障。细菌的多样性造成病原特异的巨噬细胞应答。针对病原菌与宿主相互作用的研究能够帮助我们理解宿主的防御策略和相应的病原菌的逃避策略。有关副猪嗜血杆菌与猪肺泡巨噬细胞的相互作用的研究已有学者报道。但是未见副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的免疫应答机制的报道。高通量的cDNA芯片技术为研究宿主与病原菌相互作用提供了一个有力的工具。该技术已经被广泛的应用到细胞和组织对抗病原感染的差异表达基因的分析中。在本研究中,我们应用高通量的cDNA技术研究猪肺泡巨噬细胞在副猪嗜血杆菌感染后转录组的变化来揭示副猪嗜血杆菌感染引起的机体天然免疫应答的机制。 1.副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学研究 应用昂飞公司的高通量cDNA芯片,在副猪嗜血杆菌感染后6天的猪肺泡巨噬细胞中共鉴定到428个差异表达的基因。通过对这些基因进行注释、生物进程分析、通路分析、相互作用分析发现这些基因主要属于炎性反应、免疫应答、微管聚合、转录调节因子和信号传导调节因子。通路分析的结果表明,主要的通路包括：细胞吸附分子(p=3.74E-12)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(p=2.18E-10)、Toll样受体信号通路(p=1.93E-05)和MAPK(p=7.63E-04)信号通路等。通过对属于这些通路的差异表达基因的分析表明机体通过不同的策略激活炎症反应和免疫应答来对抗副猪嗜血杆菌的感染。特别的,许多差异表达基因与吞噬作用,吞噬溶酶体形成,细胞因子产生和一氧化氮产生等巨噬细胞发挥生物学功能的生物进程相关。这些差异基因能够帮助我们更好的理解巨噬细胞发挥其生物学功能的复杂的机制。进一步,全部428个基因编码的蛋白的相互作用网络和六个重要的子互作网络用STRING和IPA预测。通过对差异表达基因编码的蛋白的互作分析表明,大多数差异表达基因编码的蛋白存在相互作用。但是有些差异表达基因编码的蛋白之间可能并不存在相互作用或相互作用还没有被发现。在差异表达基因中,我们发现coronin1a, s100a4和s1OOa6三个基因在许多生物进程及通路中发挥着重要的作用,提示这三个基因可能是新的副猪嗜血杆菌感染相关基因。为了研究这三个基因,我们克隆并测序了猪的coronin1a, s100a4和sl00a6基因。序列上传NCBI:coronin1a ID:[GenBank:JN092377]; sl00a4ID:[GenBank:JN122624.1]; sl00a6ID:[GenBank:DQ372082.1],这三个基因均为首次在猪中报道。对这三个基因进化树分析表明,猪的CORONIN1A与牛的CORONIN1A聚到一个分支上；猪的S100A6与马的S100A6聚到一个分支上；猪的S100A4与人、猕猴、黑猩猩和毛猩猩的同源性较高。对这三个基因的结构预测表明,猪的CORONIN1A在N端具有可能的Trp-Asp (WD) repeats signature, Trp-Asp (WD) repeats profile and Trp-Asp (WD) repeats circular profile等功能结构域；猪的S100A4和S100A6具有可能的S-100calcium binding protein signature, EF-hand calcium-binding domain profile等功能结构域。我们进一步研究了这三个基因的组织分布。结果表明猪coronin1a, sl00a4和s100a6分别在胰腺,小脑,胰腺中的表达量最高。我们进一步挑选S100A4和S100A6进行免疫刺激实验。实验结果表明,s100a4和s100a6在PK-15细胞内能够被LPS和Poly (I:C)在48小时内诱导上调表达。另外,我们还比较了S100A4和S100A6在感染副猪嗜血杆菌与正常猪的组织中的表达情况。qPCR和免疫组化结果表明S100A4和S100A6在副猪嗜血杆菌感染的猪的肺脏、脾脏和淋巴结中上调表达。证明S100A4和S100A6是两个新鉴定到的副猪嗜血杆菌感染相关基因。 2. LAMP法检测副猪嗜血杆菌 以副猪嗜血杆菌16S rRNA基因为靶基因,建立了检测副猪嗜血杆菌的环介导恒温扩增法。反应在61℃温度下进行,60分钟内能完成LAMP扩增。结果可以通过电泳和染色进行观察。通过对31株副猪嗜血杆菌和28株其它种属的细菌的检测表明,LAMP具有高度特异性,并且具有比nested PCR更高的检测灵敏度。我们进一步应用LAMP、nested PCR和细菌分离对临床样品和人工感染样品进行检测。LAMP、nested PCR和细菌分离分别用于针对55份健康猪肺脏的检测中。结果显示,应用这三种检测方法均不能在55份健康猪的肺脏中检测到副猪嗜血杆菌。LAMP、 nested PCR和细菌分离三种方法用于针对122份具有呼吸道症状的猪的肺脏的检测中。65份病料中细菌分离、nested PCR和LAMP均可检测到副猪嗜血杆菌。LAMP比nested PCR多检测到16份阳性病料(P=0.02,X2检验)。而针对人工感染猪的组织的检测中,LAMP检测结果与nested PCR一致。