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《华中农业大学》 2011年
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重组乙型肝炎疫苗对基因表达变化及细胞凋亡影响的研究

何亚梦  
【摘要】:重组乙型肝炎疫苗是由中国仓鼠卵巢细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),经纯化加佐剂(铝盐)吸附后制成的疫苗。虽然乙型肝炎疫苗可以预防乙型肝炎,但以往的研究表明,它仍有可能出现一些不良反应,比较常见的是接种部位出现硬结,疼痛或瘙痒。其他不良反应有腹泻、头晕、全身无力,头痛,烦躁不安,食欲不振,轻度发烧等。疫苗最有害影响的是其化学成分,如铝,就是作为佐剂在乙肝疫苗中起辅助使用。突发不良事件的早期发现对疫苗的安全性是非常重要的。然而,制药公司通常只进行疫苗的安全测试,但对世界卫生组织(WHO)和药物药典所要求的,一般毒性试验和由乙肝疫苗引起的基因表达情况却不进行测试。因此,我们应用更敏感和更科学的方法来检测疫苗的质量安全。 1.体内研究,我们采用新的基因表达分析技术,来检测乙肝疫苗对小鼠肝脏中炎症和代谢相关基因的影响。我们将24只小鼠分成3组,第一组和第二组各有9只小鼠,分别用人体剂量的1倍,2倍乙肝疫苗处理,第三组有6只小鼠,为对照组。芯片数据显示,在接种疫苗一天以后肝脏中有144个基因发生了明显的改变。随后,我们分别选取接种1天、4天和7天的样品,选择与炎症反应相关的基因(S100A8, S100A9, Saa2和Fgl1)以及与代谢相关的基因 (Acaa1a, Acaa1b和Pck1)应用定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)得到了验证。 2.定量PCR结果表明:接种2倍剂量乙肝疫苗的实验组中,S100A8基因随着时间的延长,表达水平也明显增加;而用1倍剂量处理的实验组中,S100A8基因只有在第1和第4天表达量显著增加。这表明用两倍疫苗剂量进行接种可延长其作用效果。在Saa2, S100A9和Acaalb基因中也获得了类似的结果,但两个实验组中的Fgll, Acaala和Pckl基因只在接种后的第一天表达量增加。这些基因的表达水平可以被认为是疫苗效果的一种生物标志物,这可以反映出疫苗的亚毒性或不利的影响,尤其是对肝脏损伤的影响。这项研究验证了这一假说,传统的毒理学标准认为一倍剂量的疫苗不会有明显的毒性,基因表达分析可以揭示该剂量对肝脏的损伤。芯片不能取代经典的毒性实验,但它可以在临床上用于研发疫苗。 3.体外研究,为了解释乙肝疫苗可能诱导细胞凋亡的形成,建立研究疫苗诱导产生细胞毒性机制的体外模型,并研究疫苗诱导细胞凋亡的机制。用2倍佐剂剂量的乙肝疫苗(0.5和1μg蛋白质每毫升)处理Hepal6(小鼠肝癌细胞系),处理后24,48和72小时观察细胞完整性。采用流式细胞术和TUNEL法来检测乙肝疫苗引起的细胞调亡。伴随着疫苗暴露,有活性的caspase3的水平显著上升,而Caspase家族蛋白是一类蛋白水解酶,在细胞凋亡途径中起重要作用,尤其是caspase3是凋亡过程关键蛋白酶。 4.采用定量PCR方法检测与细胞凋亡相关基因表达水平的改变情况凋亡体中Apafl和caspase9表达的增加证实细胞色素C的释放导致caspase的活化继而引起细胞凋亡。caspase3和caspase7的活化,触发细胞凋亡的特征如DNA片段化和细胞膜的收缩分别由ICAD和ROCK1的活化所引起。 总结以上研究结果,本文以Hepa1-6细胞系为模型的体外和体内研究表明,乙肝疫苗含有铝佐剂,对炎症和消化代谢基因的表达有影响,是一种细胞凋亡的潜在诱导因素。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R186

【共引文献】
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