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《华中农业大学》 2011年
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核心顺式元件HDZIP2ATATHB2依赖的海岛棉表皮原因子1(GbPDF1)在棉花纤维起始过程中起重要作用

邓锋林  
【摘要】:棉花纤维是棉花的主要产品,是世界上最重要的天然纤维。棉花纤维是在开花当天前后从胚珠外珠被表皮细胞突起后伸长而成的具有特殊结构的单细胞,一直以来被视为研究细胞伸长及次生壁合成的模式材料,同时在相关领域也取得了很好的进展。但是,就纤维如何从胚珠外珠被表皮原细胞分化形成具有突起能力的原纤维细胞、以及原纤维细胞如何向外突起形成具有快速伸长能力的纤维细胞这两个问题进行的研究虽在增多,但所取得的实验证据和理论支持还不够充足。由于成熟棉花纤维的产量及品质在一定程度上依赖于胚珠表皮细胞分化形成纤维细胞的数目以及纤维起始的时间早晚,对这一发育过程中进行分子生物学研究就显得非常必要,不仅可以丰富现有理论,在实践中为利用基因工程改良棉花纤维的产量和品质提供一条有效途径。 本研究以海岛棉来源的GbPDF1为出发点,对其基因结构、表达模式以及在棉花纤维起始过程中的功能和作用机制进行了系统的分析和探讨,在分离了与之相互作用的蛋白分子之外,还对其转录调控机制进行了的研究。其主要结果如下: 1.海岛棉与陆地棉中PDF1基因的结构及氨基酸序列分析 根据海岛棉花纤维发育平衡化cDNA中的GbPDF1序列信息,分别从海岛棉3-79和陆地棉TM-1的基因组中扩增得到3条和2条PDFl的DNA片段;根据这五条序列内含子的数目将其分为3类:Type Ⅰ(无内含子),有1个(Type Ⅱ)或2个内含子(Type Ⅲ);编码氨基酸序列比对结果显示Type Ⅰ与Type Ⅱ所包含的三条序列几乎一致,但Type Ⅲ的两条序列则具有更多"SYGGGSPP"重复单元;不同物种间PDF1蛋白在羧基端保守性较强。 2.抑制棉花中PDF1的表达推迟了纤维的分化 通过RNAi的方法,获得了PDFl受抑制的转基因棉花植株,通过扫描电镜分析发现转基因材料胚珠表面的纤维突起进程比野生型缓慢,具体表现为:开花前12小时左右野生型已有明显可见突起的纤维细胞,而PDF1被干涉植株胚珠表面未见有纤维突起;1DPA的野生型胚珠表面纤维已开始伸长,但同一时期干涉株系胚珠上才可见到刚突起纤维细胞;PDF1表达被抑制株系成熟纤维衣分下降,长度变短。 3.PDF1调控纤维发育的可能机制 PDF1表达被抑制的转基因棉花胚珠中H2O2含量比野生型有明显的增加,但通过间接分析发现乙烯的含量没有受到促进,反倒有可能出现下降;同时由于编码碳源转运及某种特殊结构果胶多糖合成关键酶类基因表达丰度的下降,可能降低了果胶质合成的效率,最终导致纤维发育受阻。 4.与GbPDF1相互作用蛋白质的分离 通过酵母双杂交的方式以GAL4-DBD::GbPDF1融合蛋白为诱饵进行筛库获得了13个可能与之相互作用的蛋白,重新转化及双分子荧光互补实验验证了三个蛋白(PPIP1,PPIP2和PPIP3)可与其发生相互作用。这三个蛋白均具有保守结构域,可能分别参与蛋白酶体介导的蛋白降解、细胞内特定膜相关蛋白的运送及H2O2含量的调控、磷脂蛋白信号传导等生理生化过程。 5.烟草中超量表达GbPDF1促进其初生根增长 获得了组成型启动子驱动GbPDF1在烟草中表达的T2代纯系,三次重复实验结果表明这些转基因烟草从萌发后1天开始其初生根就比野生型要长。 6.GbPDF1启动子的分离及表达模式分析 通过Genome-Walking的方法获得了GbPDF1基因的两条启动子序列,分别命名为PGbPDF1-1(1679bp)及PGbPDF1-2(1285bp);这两条序列从翻译起始位点ATG开始至其上游390bp处的片段DNA组成几乎一致;分别将PGbPDF1-1和PGbPDF1-1与GUS融合获得转基因棉花植株,通过报告基因检测发现这两个启动子的具有一致的表达模式:在开花当天的胚珠中表达丰度最高,而3~15DPA的胚珠及纤维中GUS蛋白活性逐渐降低。 7. GbPDF1转录所必需启动子序列及核心顺式元件的确定 通过启动子5’端的逐渐缺失发现长度为236bp的启动子足够驱动下游基因在胚珠及纤维中的表达,-128~-236bp对GbPDF1基因的转录是必须的;对该区域可能起作用的几个顺式元件分别突变后转化拟南芥,发现一个长度为9bp的名为HDZIP2ATATHB2的调控序列对该启动子正常工作是必不可少的,凝胶阻滞实验结果表明拟南芥生殖器官及海岛棉开花后5天纤维中的核提取物可与该元件在体外相互结合。 根据上述研究所得结论,可以认为PDF1在棉花纤维的起始过程中行使重要的功能。PDF1在纤维起始过程中可能通过调控胚珠表皮原细胞内H202含量来维持乙烯和果胶质类物质的正常合成并最终形成原纤维细胞。GbPDF1基因启动子-178~-186bp处HDZIP2ATATHB2这一顺式作用元件对该基因的正常表达是必不可少的。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S562

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