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华癸中慢生根瘤菌ctrA突变体构建及其宿主互作蛋白初步筛选

刘流  
【摘要】:ctr A在a-变形细菌中普遍存在,是细菌分裂周期和不对称分化的调控因子,在双组分调控系统中充当应答调节子。类菌体的发育也涉及到根瘤菌的分裂分化过程,分析认为ctrA基因可能参与根瘤菌类菌体分化或共生固氮,亦可能接受宿主植物来源的控制作用。但是相关的研究报道和文献很少。 本实验通过构建同源双交换置换载体pJQ200SK-ctrA,试图直接筛选华癸中慢生根瘤菌7653RctrA基因插入失活突变体。但是一直未能获得预期的突变体,考虑到ctrA基因可能存在突变致死性,本研究调整了筛选路线和策略,重新构建了ctrA渗漏表达载体pUN-ctrA和双交换质粒,为后续筛选目标突变体奠定了基础条件。 另外一方面,通过构建组成型表达载体pBBR-ctrA,通过接合转移技术,将额外拷贝的ctrA引入华癸根瘤菌7653R中,观察根瘤菌自生条件和共生条件下的生长情况。结果发现其不影响7653R在自生培养时的生长;但是其共生表型为结瘤数量减少、固氮酶活性有所降低。荧光定量PCR检测ctrA表达量,结果表明:ctrA在自生和共生条件下呈组成型表达特点,且在不同时期根瘤中其表达水平差异不明显。引入额外组成型拷贝ctrA可导致根瘤中的表达量稍增强。 同时,以构建pGBKT7-ctrA质粒作为诱饵,通过酵母双杂交技术,筛选前期已构建的紫云英AD-cDNA文库。最终结果获得4个阳性克隆,其中包括一个JUN激酶激活域结合蛋白。 最后,基于ctrA box序列的保守性,本文对于华癸根瘤菌7653R基因组中可能接受CtrA调控的基因进行搜素和分析。结果得到64个可能受CtrA调控的基因。其中发现一个新现象,CtrA可能调控7653R中结瘤固氮相关功能基因的表达,例如opa22,minCD,ftsZ等。 以上结果为后期深入探究ctrA在类菌体分化、固氮及菌植互作中的功能及调控,提供了一定的工作基础和新线索。


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