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番木瓜WRKY转录因子的基因表达谱及其功能的初步研究

潘林杰  
【摘要】:植物在面对大自然中各种生物胁迫和非生物胁迫时会采用多种机制来适应环境。在植物与自然的相互作用研究过程中,越来越多的学者开始关注植物体在基因水平上的调节作用。近几年,有关转录因子的研究已逐渐成为当今植物基因组的一个热点。WRKY转录因子在植物体中起着应答各种生物胁迫与非生物胁迫的重要调节作用,分离植物WRKY家族的不同成员并鉴定其功能是阐明植物抗逆分子机制的重要途径。 本研究首先利用SUPERFAMILY数据库,得到推测的番木瓜WRKY转录因子的氨基酸序列,借助Genebank数据库资源建立了本地的番木瓜Genome和EST数据库,从而利用tBlastn工具获得了番木瓜45个WRKY转录因子的编码序列。对其中13个WRKY基因进行胁迫诱导,利用荧光定量PCR技术检测基因表达水平,选取其中一个表达差异明显的WRKY基因进行初步的功能研究。现主要获得以下结果: 1.在番木瓜中发现45个WRKY转录因子,获得其推测的基因编码序列,并将其分为4类。在SUPERFAMILY数据库中搜索得到56个WRKY结构域分布于50个蛋白质中,经过序列比对、除去冗余之后得到45个WRKY转录因子及氨基酸序列。借助已经完成测序的番木瓜基因组,利用tBlastn工具获得了这45个番木瓜WRKY转录因子的编码序列。根据所含WRKY结构域的个数和锌指结构的类型,将其分为4类:第Ⅰ类含有6个,第Ⅱ类含有30个,第Ⅲ类含有7个,第Ⅳ类含有2个。 2.通过水杨酸(SA)、低温、干旱、创伤、病原侵染等多种胁迫诱导,得到13个番木瓜WRKY转录因子的基因表达谱。利用荧光定量PCR技术,对胁迫处理后的番木瓜苗在转录水平进行分析,检测其中13个WRKY转录因子的表达量变化。结果显示,这13个番木瓜WRFKY转录因子除evm.TU.supercontig_1.102以下简称为TF1.102)外,其他转录WRKY因子受生物胁迫或非生物胁迫诱导表达,其中TF12.199,TF807.3,TF9.353个WRKY转录因子对5种处理都受诱导,说明这13个WRKY转录因子中有12个或多或少在抗胁迫反应中起到了一定的调控作用。 3.成功克隆得到一个番木瓜WRKY转录因子基因的全长编码区。分析番木瓜WRKY转录因子的基因表达谱,选取其中一个表达差异明显的WRKY基因TF807.3进行RT-PCR克隆,得到了一个558bp的cDNA序列,经测序与蛋白质保守结构域分析,确定其为番木瓜WRKY转录因子家族的一员。 4.利用农杆菌渗透法,将TF807.3在番木瓜叶片中瞬时超表达,发现番木瓜抗病相关基因CpSGTl和CpRARl表达水平明显上调。通过构建植物超表达载体pCAMBIA3300-TF807.3转化到农杆菌GV3101中,构建农杆菌介导的番木瓜瞬时表达体系,分析TF807.3超表达的番木瓜叶片中抗病相关基因SGT1和RAR1的表达差异。结果显示,在农杆菌侵染3d后,TF8023在番木瓜叶片中得到超表达,SGT1和RARl的表达量分别上调2.4倍和4.5倍,说明TF8023参与到SGT1和RAR1相关的抗病反应途径中。


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