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色素荧光蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中表达

常坤  
【摘要】:绿色荧光蛋白(GFP)具有优异的荧光活性,作为报告基因与靶蛋白融合,示踪靶蛋白在活细胞内的位置、移动及相互作用。蓝细菌中的色素蛋白具有丰富的光谱范围,可弥补绿色荧光蛋白光谱的不足,拓展荧光蛋白标签在细胞生物学研究中的应用。绿色荧光蛋白与色素蛋白的融合进一步拓宽光谱的检测范围,能用作二色、多色标记,可作荧光探针用于定位。另外,蓝细菌中色素蛋白潜在的生物活性也引起人们的重视,如作为光敏剂和抗氧化活性用于光动力学治疗。 本文研究包括以下几个方面: (1)绿色荧光蛋白肌动蛋白融合基因的克隆与在原核表达系统中表达。首先从大肠杆菌中克隆出肌动蛋白基因mreB,与gfp基因融合,构建质粒pCDFDuet-mreB:gfp,转入大肠杆菌,经荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征以及蛋白质电泳结果证明融合基因在大肠杆菌中表达。 (2)绿色荧光蛋白和胆绿素还原酶基因pcyA在毕赤酵母菌株GS115中表达。首先构建酵母质粒pPICZB-gfp和pPICZB-gfp:pcyA,以电转化方式分别导入巴斯德酵母菌株GS115基因组中,筛选阳性克隆子,进行诱导表达。由荧光显微镜图像,荧光和吸收光谱特征以及蛋白质电泳结果证明gfp基因和gfp.pcyA融合基因在酵母中表达成功,初步建立毕赤酵母表达系统,构建出外源蛋白的酵母表达平台。 (3)毕赤酵母双色荧光蛋白表达体系的构建。首先克隆出酵母线粒体膜蛋白基因f0并与gfp(△SacI):pcyA基因融合,构建酵母表达质粒pPIC3.5K:f0:gfP(△SacI):pcyA,以电转化方式导入菌株GS115基因组中,得到的阳性克隆子诱导表达。通过荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征筛选出工程菌GS115/pPIC3.5K:f0:gfp(△SacI):pcyA。然后构建含GAF3结构域的光敏色素酵母质粒pPICZB:abpl:gaf3:hol,同样以电转化方式导入工程菌GS115/pPIC3.5K:f0:gfp(△SacI):pcyA基因组中。经PCR筛选的阳性克隆子,在BMMY培养基中诱导表达,通过荧光显微镜图像、荧光和吸收光谱特征等方式检测,光敏色素蛋白在毕赤酵母中未能表达成功,需进一步探索。


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