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B-二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)降解代谢相关功能新基因的克隆及初步鉴定

汪鹏  
【摘要】:β-二甲基巯基丙酸内盐(DMSP:dimethylsulfoniopropionae;分子式(CH3)2-S-CH2-CH2-COOH)是一种广泛存在于海洋表面水体的有机生源含硫化合物,它不仅在海洋生态系和生物地球化学循环过程中发挥重要作用,其降解产物还能够影响环境酸化和气候变化,因而其降解代谢过程已成为领域研究热点之一。Pseudomonas sp. B22-1是本室前期从红树林土壤中分离获得的一株既能以DMSP为唯一碳源生长,又能降解DMSP产生DMS的菌株。本研究基于构建基因组Cosmid文库和Tn5转座子随机插入突变库,对其DMSP降解代谢途径中的相关功能新基因进行了分离与鉴定研究,获得如下研究结果: 1.构建获得一个由2200个克隆子组成的B22-1基因组Cosmid文库。但是经平板涂布法和气相色谱法筛选,均没有获得DMSP代谢相关的功能基因。 2.构建获得一个由10,000个突变株组成的Pseudomonas sp. B22-1的Tn5转座子随机插入突变体库。获得了3株不能以DMSP和醋酸盐为唯一碳源生长,而能在葡萄糖和甜菜碱为唯一碳源培养基上生长的突变株Mu-1-B10、Mu-20-B7和Mu-38-H11。突变株Mu-1-B10、Mu-20-B7产DMS的能力与野生菌B22-1相当。 3.采用TAIL-PCR技术,对3株突变株中的Tn5转座子侧翼序列进行扩增、测序和同源比对,发现突变株Mu-1-B10和Mu-20-B7中的Tn5转座子插入位点在于Pseudomonas sp. B22-1的同一个基因——苹果酸醌氧化还原酶基因(mqo)上;Mu-38-H11中的Tn5转座子插入位点位于醇脱氢酶基因上。 4.利用出发菌株Pseudomonas sp. B22-1的mqo基因,对突变株进行了功能互补实验,发现其能够恢复突变株对DMSP的代谢功能表型。 5.采用荧光定量PCR技术,测定了不同碳源条件下mqo基因的表达水平。研究结果表明,该基因呈DMSP诱导增强表达。在以DMSP为唯一碳源条件下,mqo表达水平比在以葡萄糖为唯一碳源条件下的表达水平高7倍。 以上研究结果表明,mqo基因对于Pseudomonas sp. B22-1的DMSP降解代谢是必需的。该基因是目前被分离鉴定的第一个与DMSP代谢有关的碳中心代谢过程中的功能基因。本研究结果为阐明DMSP的降解代谢途径提供了直接实验证据,为进一步揭示DMSP分解代谢的完整途径奠定了良好的工作基础和切入点。


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