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《华中农业大学》 2013年
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应用SELEX技术体外筛选PRRSV核衣壳蛋白的DNA适配子

李枫  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪繁殖与呼吸综合征,俗称“蓝耳病”。该病1987年最早报道于美国,1991在荷兰分离到病毒,我国大陆哈尔滨兽医研究所于1996年首次报道并分离到病原,目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪也带来巨大的经济损失。PRRSV不分节段单股正链的RNA病毒,为尼多目动脉炎病毒属,成熟病毒粒子直径约50-60nm,有囊膜。基因组全长约15kb,共有9个开放阅读框(ORFs)。ORF7编码约15kDa的核衣壳(N)蛋白。N蛋白在病毒表达的蛋白中含量高,有4-5个抗原决定簇,免疫原性极强,因此非常适合用于疾病诊断。 指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SLEXE)技术是上世纪九十年代产生的一种新型组合化学技术。应用SELEX技术可以从一个大容量随机寡聚核苷酸文库中筛选针对靶物质的亲和性和特异性的适配子。本实验首次运用SELEX技术筛选特异性针对PRRSV N蛋白的ssDNA适配子。通过测定适配子与N蛋白的亲和性和专一性,评估适配子应用于PRRSV的早期诊断价值。主要研究内容包括: 1. PRRSV核衣壳蛋白的表达纯化 原核表达质粒pET-30a (+)-PRRSV-N转化E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下大量表达带有6个his标签的PRRSVN蛋白,通过Ni-NTA柱纯化后,PAGE鉴定,得到高纯度的融合表达蛋白。 2.合成初始随机寡聚核苷酸文库及引物 体外化学合成一个中间具有40个随机核苷酸序列的大容量初始随机寡聚核苷酸(ssDNA)文库,随机区两端带有18nt固定序列,该文库含有大量的序列(10’5)。引物根据两端固定序列区设计,用于SELEX筛选中次级文库的克隆。 3.SELEX过程 在SELEX过程中,将初始文库转化成dsDNA,作为模板用不对称PCR扩增生成ssDNA文库,ssDNA文库先与空白微孔,PRRSV GP5或阴性血清孵育以减少非特异性序列的富集,再与固定在微孔板上的N蛋白孵育,洗脱特异性结合序列。在下一轮筛选中,洗脱的ssDNA序列作为模板生成dsDNA,然后再生成ssDNA文库,依次进行筛选和洗脱,周而复始。本实验共完成15轮筛选。将最后得到的特异性序列克隆至pGEM(?)-T Vector,转化DH5α,我们挑取了34个单克隆菌落。经双酶切鉴定和PCR方法鉴定,测序,获得26个亲和性适配子序列。 4.适配子功能分析 生物素标记的适配子作为“一抗”,辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为“二抗",用ELISA的方法检测适配子和PRRSVN蛋白之间的亲和性和特异性,显示得到针对N蛋白的24个亲和性和特异性适配子,一些适配子具有亲和PRRSV特性。碱基组成分析显示26条适配子序列均富含C或T,这可能与亲和PRRSV核衣壳蛋白有关。序列比对分析表明有7个序列出现2次,若干序列之间具有保守的片段。应用DNAMAN软件模拟二级结构,保守序列位于环的顶端或环之间的序列中。 本研究建立以微孔板为介质的SELEX筛选方法,成功筛选到针对PRRSVN蛋白的亲和性适配子,为适配子应用于PRRSV早期检测做出了初步的研究。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S858.28

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