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《华中农业大学》 2013年
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猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立

闫少侠  
【摘要】:流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus, C. abortus)是引起猪、牛、羊等家畜流产、死胎等繁殖系统疾病的重要病原体,每年给畜牧养殖业造成重大的经济损失。同时,作为一种重要的人畜共患病原体,也给人类的公共卫生安全带来严重的危害。近几年来的猪场流行病学调查结果表明,我国猪场中衣原体流行相当普遍。目前,猪场中都没有使用衣原体疫苗进行免疫预防,因此检测血清中抗体可以作为该病临床诊断的重要依据。因此,本研究利用重组MOMP蛋白和单克隆抗体建立一种快速、简便的阻断ELISA抗体检测方法,为临床检测提供技术支持。1.猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达 以猪流产嗜性衣原体HB1043株的全基因组DNA为模板,设计特异性引物进行PCR,扩增得到全长的MOMP基因,连接T载体并测序。对基因序列进行分析后,选择271-1176bp进行克隆表达。构建重组表达质粒pET-28a-MOMP,转化BL21进行诱导表达,并采用镍离子亲合层析柱对表达产物纯化,得到34kDa的重组蛋白,经Western-Blot检测证实重组蛋白具有免疫学活性。 2. MOMP单克隆抗体制备 使用甲醛灭活的衣原体鸡胚卵黄囊液离心后的上清与弗氏佐剂混合作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠。经三次免疫后,使用重组MOMP蛋白间接ELISA方法检测血清效价。当血清效价达到1:3200时进行融合,使用间接ELISA方法筛选阳性克隆。最后筛选出5株特异性强、可以稳定传代的杂交瘤细胞株:5D7、1D3、4E5、1E6、4C9。进一步鉴定结果表明,5D7和1E6的亚型分别为IgGl和IgG3,其余三株亚型均为IgG2b;腹水效价为105-106。采用辛酸硫酸铵法对效价较高的两株单克隆抗体的腹水进行纯化,最后用HRP进行标记。 3.阻断ELISA抗体检测方法的建立 以重组MOMP作为抗原包被ELISA板,以酶标4C9株单抗作为酶标物建立阻断ELISA抗体检测方法。经试验优化后选择的反应条件为:蛋白稀释80倍,待检血清2倍稀释,酶标单抗32000倍稀释作为最佳工作浓度。结果判定的临界值为0.377。用现行标准检测方法IHA与建立的阻断ELISA方法同时检测261份血清,两种方法的总体符合率为78.5%;阳性符合率为85.6%;阴性符合率为62.5%。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S858.28

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【参考文献】
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