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《华中农业大学》 2013年
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水稻中激素和肌醇磷酸代谢相关基因的抗逆功能研究

都浩  
【摘要】:干旱、高盐、极端温度等非生物逆境是植物生长发育过程中最重要的限制因子,植物对非生物逆境的响应伴随着对生长发育过程很多基因的调。水稻是世界最重要的粮食作物之一,维持正常的发育过程和产量需要很好的气候条件,然而缺乏的淡水资源和极端的温度经常发生,严重影响水稻的产量。因此提高作物对非生物逆境的抗性是我们亟待解决的事情,在过去的几十年中,人们努力寻找可以提高作物抗逆性的基因,很多研究发现超量表达或抑制表达一些基因可以显著提高作物的抗逆性。 Abscisic acid(ABA),乙烯,生长素和肌醇三磷酸IP3通过复杂的信号传导和代谢过程,调控植物生长发育和应答环境信号。然而这些信号分子与非生物逆境之间的关系还有很多未知的地方。为了在水稻中鉴定一些和非生物逆境相关的基因,我们筛选了水稻T-DNA插入突变体及超表达一些非生物逆境诱导的候选基因。我们对两个个干旱敏感的突变体(dsm2,dsm3)和一个抗旱突变体(osetol1)的基因进行了深入功能分析。此外,我们还基于OsGH3-2超表达水稻干旱敏感表型分析了该基因的抗逆功能。主要结果如下: 干旱敏感的突变体dsm2由于T-DNA插入失活的是一个编码p-胡萝卜素羟化酶的基因,该基因的转录水平在微管组织及孕穗期叶片中表达量较高,且受干旱、高盐及紫外线处理诱导上升表达,该基因编码一个叶绿体蛋白催化由β-胡萝卜素生成玉米黄质的反应,此过程也是ABA合成途径中的重要步骤之一。在干旱胁迫条件下,突变体对干旱非常敏感主要表现在失水速率快,相对含水量较低,光合速率、花粉育性、结实率、生物量均显著低于对照,而丙二醛含量及气孔开放率显著高于对照,是由于突变体在干旱胁迫条件下,ABA含量显著下降。此外突变体对氧化胁迫处理如紫外线(UV)及甲基紫精(MV)表现敏感,叶绿体荧光参数测定表明突变体光能转化效率(Fv/Fm)及非光化学猝灭(NPQ)能力较野生型对照显著降低,表明在突变体中光合系统Ⅱ中极易出现光抑制现象,高效液相色谱结果表明突变体中玉米黄质含量下降致使参与高光保护及消除活性氧的叶黄质循环处于较低的水平,导致dsm2突变体对氧化胁迫敏感的表型。DSM2超量表达的水稻植株表现出对干旱及氧化胁迫较强的抵抗能力,以及较强的叶黄质循环水平和光保护能力,主要是由于较高的叶黄质循环水平。此外突变体和超表达植株在干旱胁迫前后一些ABA合成和信号传导相关基因,及氧化胁迫相关基因表达量有显著差异。DSM2同源序列比对发现水稻基因组中共有三个同源基因,但由于该家族基因在进化过程中启动子区段出现了不同的选择,DSM2基因启动子区域富集逆境相关的顺式作用元件,其受干旱和UV诱导最强,与另外两个同源基因表现出不同的逆境诱导表达模式和组织特异性表达模式。 干旱敏感的突变体dsm3由于T-DNA插入失活的是一个编码肌醇1,3,4三磷酸-5/6激酶的基因OsITPK2/DSM3,该基因的转录水平在茎节及孕穗期叶片中表达量较高,在幼根幼穗中表达较低,且受干旱、高盐及ABA处理诱导上升表达,该基因编码一个内质网蛋白催化由肌醇三磷酸(IP3)生成肌醇四磷酸(IP4)的反应,此过程也是肌醇多磷酸代谢途径中的重要步骤之一。在干旱胁迫条件下,突变体dsm3对干旱非常敏感主要表现在脯氨酸、可溶性糖、花粉育性、结实率、生物量均显著低于对照,而氧化胁迫产物丙二醛含量显著高于对照表明突变体的抗氧化能力显著降低,可能是由于突变体在干旱胁迫条件下,信号分子肌醇三磷酸代谢紊乱,导致干旱信号的传导不正常。构建人造小RNA抑制内源DSM3基因的表达,转基因阳性植株在干旱与高盐胁迫下与突变体表型一致。然而,DSM3基因的超量表达植株同样表现出对干旱和高盐的敏感性,而超表达植株非逆境相关生理指标也表现出与突变体相似的表型。高效液相色谱结果表明超表达植株中二级信使肌醇三磷酸(IP3)含量下降致使,突变体对干旱和高盐敏感。此外,我们检测了突变体和超表达植株在干旱胁迫前后一些非生物逆境相关基因,发现氧化胁迫相关基因表达量有显著差异,表明肌醇三磷酸(IP3)含量的改变导致氧化损伤。DSM3同源序列比对发现水稻基因组中共有6个同源基因,但由于该家族基因基因结构在基因家族形成的过程中出现了不同的选择,导致该家族成员表现出不同的逆境诱导表达模式和组织特异性表达模式。 osetoll是一个抗旱但对涝害敏感突变体。该突变是由于T-DNA插入一个编码含有BTB结构域的E3连接酶基因而失活。该基因在我们突变体库里有两个等位突变体命名为osetoll-1(?)(?)osetoll-2,该突变体表现为孕穗期在干旱胁迫条件下较高的结实率和生物量,但在涝胁迫条件下表现出较慢的生长速度。在水稻中超表达OsETOLl表现出与突变体相反的表型。对OsETOLl的组织表达谱和非生物逆境表达谱分析发现,OsETOL1主要在成熟组织表达,可以被干旱和涝强烈诱导,而且表现出与该家族其余2个成员OsETOL2(?)(?)OsETOL3不同的表达模式。基因表达分析发现(sETOL1主要影响淀粉代谢和糖酵解相关基因的表达,说明OsETOL1可能是能量代谢的调控子。酵母双杂交和双分子荧光互补分析发现OsETOL1可以与乙烯合成关键酶OsACS2互作,互作位置在细胞质。此外,我们在突变体库中找到乙烯合成基因OsACS2的突变体osacs2.色谱分析表明在osacs2突变体(?)(?)OsETOL1超表达水稻中ACC和乙烯含量显著下降。此外,10μM外源ACC处理可以恢复osacs2突变体中和OsETOL1超表达水稻中因ACC缺陷导致的涝胁迫下生长较慢的表型。说明OsETOL1负调控乙烯合成的机制在水稻和拟南芥中是保守的,但遗传和序列分析分析发现ETOL家族基因在水稻和拟南芥中既有功能的相似性同时也存在一定的差异。 OsGH3-2在非生物逆境抗性中也发挥重要功能。OsGH3-2编码吲哚乙酸氨基化合成酶,研究发现参与调控ABA的合成和非生物逆境的抗性,OsGH3-2基因受干旱诱导上升表达,低温抑制OsGH3-2的表达。OsGH3-2超表达水稻表现出显著的形态改变,如植株矮小、叶夹角增大、更小的剑叶、穗和节。此外,OsGH3-2超表达水稻还表现出冠根和根毛数目显著降低。液相色谱分析发现OsGH3-2超表达水稻中α-胡萝卜素和p-胡萝卜素显著下降,质谱分析发现游离IAA和ABA含量显著下降。OsGH3-2超表达水稻在干旱胁迫条件下增加气孔的开度和水分散失。然而,OsGH3-2超表达水稻表现出抵抗低温胁迫和抗氧化损伤的能力。可能是由于OsGH3-2超表达减少了游离IAA的含量,减轻了氧化损伤和低温下细胞膜的透性。实时定量PCR分析发现ABA合成和一些非生物逆境相关基因的表达发生显著变化。但是抑制OsGH3-2基因的表达没有导致株型的改变,IAA.ABA含量和对非生物逆境的抗性也没有显著差异,可能是由于OsGH3家族基因功能的冗余,对OsGH3家族基因表达谱和序列分析也发现该家族基因既存在功能的冗余性也表现出一定的特异性。 ABA缺陷型突变体phs1phs2phs3phs4和PDS-RNAi转基因植株叶片白化,体内叶绿体及内囊体膜发育畸形,我们用液相色谱仪-质谱检测了,这些植株体内的类胡萝卜素、ABA和IAA含量发现类胡萝卜素和ABA显著下降,体内IAA的合成也显著降低,在干旱胁迫条件下ABA缺陷型植株保持比对照更高的气孔开放率,在苗期干旱胁迫条件下phs3-1和PDS-RNAi转基因植株叶片萎蔫显著快于对照,严重干旱胁迫恢复后,phs3-1和PDS-RNAi转基因植株的成活率显著低于对照,表明phs3-1和PDS-RNAi转基因植株对干旱敏感,实时定量PCR检测发现phs3-1和PDS-RNAi转基因植株内,依赖于ABA信号的某些干旱应答基因如编码bZIP转录因子和LEA蛋白的一些基因,在干旱胁迫状态下的phs3-1和PDS-RNAi转基因植株中诱导的强度显著低于阴性对照。有趣的是我们发现,phs3-1和PDS-RNAi转基因植株对低温表现出较高的抗性,这一点可能是由于phs3-1和PDS-RNAi转基因植株内源IAA含量显著下降,减弱了低温胁迫下植物膜系统的氧化损伤,并增强了低温胁迫下细胞膜的稳定性。为了确信ABA缺陷型植株体内IAA含量的下降是由内源ABA含量下降造成,我们用外源施加不同浓度的ABA合成抑制剂氟啶酮(fluridone),抑制内源ABA的合成,发现叶片部分白化,内源ABA和IAA含量也显著下降,实时定量PCR检测发现参与生长素合成的部分基因YUCCA和OASA表达显著下降,而部分GH3家族基因表达量显著上升,类似于ABA缺陷型突变体phs1phs2phs3及phs4。此外,我们用外源施加特定浓度的IAA和ABA的,发现外源IAA可以部分恢复phs3-1株高变矮的表型。表明ABA缺陷型植株降低内源IAA的含量,差异影响植株对低温干旱的抗性。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S511

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