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《华中农业大学》 2013年
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硝酸盐还原作用对地衣芽胞杆菌合成聚γ-谷氨酸的影响分析

李欣  
【摘要】:硝酸盐是一种微生物可利用的重要无机氮化合物。硝酸盐在还原酶作用下经亚硝酸盐后形成氨离子。这个代谢过程对微生物具有多种生理功能,或可作为电子受体而稳定细胞膜质子梯度,或可维持胞内NAD/NADH的平衡,或可为微生物提供氮源。虽然硝酸盐还原作用的生理功能在许多微生物中被考察,但是对合成聚γ-谷氨酸(y-PGA)的影响并没有被研究。本文首先考察硝酸盐对地衣芽胞杆菌WX-02合成γ-PGA发酵的影响。同时,建立了针对γ-PGA发酵液样品的代谢组学样品处理方法。在此基础上,应用GC-MS分析手段,研究了代谢水平上硝酸盐代谢同γ-PGA合成之间的关系。最后,通过构建硝酸盐还原酶缺失菌株,考察了不同硝酸盐还原酶在γ-PGA发酵过程中的具体生理功能。主要结论如下: 1、代谢学中常规采用的离心和膜过滤的菌体分离方法对具有粘性的γ-PGA发酵液并不适用。酸处理的方法会对造成菌体死亡,并且死亡程度随pH的增加而增加。同时,稀释-离心方法和物理研磨方法只能获得不超过30%的菌体收得率。在选择的六种淬灭溶剂(无水甲醇、无水乙醇、甲醇/乙醇混合液、10M盐酸、饱和三氯乙酸和高氯酸)中,无水乙醇最合适。同时,热乙醇是五种抽提方法(热甲醇、热乙醇、冷甲醇、冷乙醇、高氯酸冻融)中最合适的。基于乙醇的代谢组学样品处理方法能为GC-MS检测提供更强的分离效果、更多的代谢物和更好的稳定性。 2、硝酸盐能有效地提高地衣芽胞杆菌WX-02的γ-PGA合成能力,其发酵终点的γ-PGA产量从22.28mg/mL提高至35.23mg/mL.硝酸盐代谢不仅提高了菌体对胞外谷氨酸的利用程度,也强化了胞内谷氨酸的合成能力。在γ-PGA发酵过程中,硝酸盐还原作用同糖酵解和氮循环的过程有着紧密关联。同时,硝酸盐还原作用受到了溶氧水平的显著影响。此外,地衣芽胞杆菌WX-02对硝酸盐和亚硝酸盐的耐受能力受培养基的营养丰富程度的影响。 3、样品中检测到的代谢物覆盖了糖酵解途径、三羧酸循环途径、有机酸代谢和氨基酸代谢等。γ-PGA的合成时,糖酵解途径、三羧酸循环途径的代谢活性会提高,而硝酸盐还原作用会进一步强化这种激活作用从而促进更多的γ-PGA被合成。可见,硝酸盐还原作用引起的地衣芽胞杆菌WX-02胞内代谢调节程度要比γ-PGA合成更深。同时,6-磷酸葡萄糖(葡萄糖进入糖酵解的第一代谢物)、谷氨酸和谷氨酰胺(氮循环的主要代谢物)的胞内池容积的变化表明它们可能是地衣芽胞杆菌WX-02代谢网络中对γ-PGA合成和硝酸盐还原作用都响应的重要节点。此外,部分代谢物的合成显示出依赖性。L-半胱氨酸只出现在硝酸盐还原作用下,而三磷酸甘油醛、戊二酸和L-丙氨酸在γ-PGA合成时积累,乙酰乙酸、丙二酸和L-缬氨酸则只在不合成γ-PGA状态下积累。丙酸是唯一的需两个作用都存在才积累的胞内代谢物。 4、呼吸硝酸盐还原酶是地衣芽胞杆菌WX-02在γ-PGA合成期间的唯一的硝酸盐还原酶。同化硝酸盐还原酶对菌株的亚硝酸盐还原过程产生巨大的影响。在地衣芽胞杆菌WX-02y-PGA发酵过程中,硝酸盐还原作用是一个呼吸-同化过程。完整的硝酸盐还原作用途径有助于细胞利用更用的外源谷氨酸。同时,这两种还原酶的生理功能同培养基中无机氮源的组合有关。另外,硝酸盐还原途径的完整性对地衣芽胞杆菌WX-02对胞外柠檬酸的利用、胞内乙酸和乙偶姻的代谢也都有显著影响。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q93

【共引文献】
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