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《华中农业大学》 2013年
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柑橘砧木耐缺硼胁迫能力差异的分子机理研究

周高峰  
【摘要】:柑橘产区土壤硼素的缺乏严重影响了柑橘的生产,成为柑橘生产上亟待解决的问题之一。柑橘一般采用嫁接繁殖,通过选择不同的砧木可以有效的提高接穗品种对低硼胁迫的耐受能力,然而不同砧木之间的耐缺硼胁迫能力是有显著差异的,其生理和分子机理目前还未完全清楚。本文通过建立柑橘砧木水培体系,探讨了不同类型柑橘砧木幼苗耐缺硼能力在形态和生理上的差异,并进一步以对缺硼最敏感和对缺硼最耐受的砧木为材料通过抑制差减杂交和cDNA芯片技术研究了其耐缺硼胁迫能力差异的分子机理。主要研究内容和结果如下: 1.不同类型柑橘砧木幼苗响应缺硼胁迫的生理和矿质营养差异 为了分析缺硼对不同类型柑橘砧木形态、生理、硼和其它矿质元素含量影响,选取了7种不同类型的柑橘砧木幼苗进行了缺硼处理,结果表明:缺硼胁迫显著抑制了柑橘砧木幼苗的生长发育、硼以及其他矿质元素的吸收,但是不同柑橘砧木幼苗对缺硼胁迫的耐受能力是不同。缺硼处理10周后,枳、香橙和枸头橙叶面出现了严重的木栓化现象,红橘,印度酸橘和枳都有严重的黄化现象,而枳橙只有轻微的失绿。缺硼胁迫显著抑制了柑橘砧木根系的生长,特别是与养分吸收相关的根系形态特征(侧根数量、根系长度、吸收表面积等)受到显著影响,在7种柑橘砧木中,枳橙受缺硼影响较小,枳受根系受影响最大。另外,通过利用高通量离子组的方法,分析不同柑橘砧木缺硼处理后各种矿质元素在根和叶中的含量的变化情况,揭示硼对其他矿质元素代谢的影响。结果表明:缺硼胁迫不仅降低了柑橘砧木各器官的硼含量,而且显著影响了其它矿质元素的吸收,尤其是降低了P、Mg、Fe和Mn的含量。因此,一些生理表型如叶片黄化、根系生长发育受阻等可以归咎于这些矿质营养含量的降低。综合分析表明在这7中柑橘砧木中,枳橙是对缺硼最耐受而枳是最敏感的砧木。 2.柑橘砧木缺硼胁迫下的抑制差减杂交文库构建 为了找出不同柑橘砧木耐缺硼的胁迫能力的分子机理,以对缺硼最敏感的枳和对缺硼最耐受的枳橙砧木为材料,分别构建了缺硼条件下根的抑制差减杂交(SSH)cDNA文库,结果表明:本文所构建的4个抑制差减杂交文库从接头连接效率、差减效率、插入片段大小和库容量进行评价都达到了较高标准,为下一步芯片杂交的进行提供了良好保证。 3. cDNA芯片杂交和生物信息学分析 通过抑制差减杂交共获得7680个克隆,经筛选后有用于cDNA芯片的点制。通过cDNA芯片杂交技术筛选差减文库差异表达的基因和生物信息学分析表明:在缺硼胁迫下,枳和枳橙在转录水平上存在显著差异。在对差异表达的基因进行测序和EST序列进行拼接,共获得139个unique基因,含45个contigs和94个singletons。采用MIPS对139条序列进行基因注释和功能分类,共划分为11个功能组,其中有13个与细胞壁代谢相关,有17个基因涉及到细胞的跨膜转运。将已知基因与KEGG数据库进行比对,发现有23条代谢途径受到缺硼的影响,其中与硼的功能最紧密的代谢途径有糖酵解途径、氮代谢途径和木质素合成途径。
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