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副猪嗜血杆菌wza基因在其粘附和抗吞噬中的作用研究

曹瑞娟  
【摘要】:副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是猪群上呼吸道的条件性致病菌,在特定条件下可以引起以纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的副猪嗜血杆菌病。HPS中wza基因编码的荚膜多糖输出蛋白在病原菌的致病过程中发挥重要的作用,本课题研究了HPS中荚膜多糖输出蛋白对其粘附及抗吞噬能力的影响,为阐明副猪嗜血杆菌定殖和扩散的分子机制提供理论基础。本课题主要取得的研究成果如下所示: 1、HPS荚膜多糖输出蛋白相关基因wza缺失株的构建 通过PCR的方法扩增wza基因的上下游同源臂片断,同时在上游同源臂5’端引物的和下游同源臂的3’端引物添加USS序列(ACCGCTTGT),再扩增卡那抗性基因表达盒,将这三个片段用重叠PCR的方法拼接后,连接到自然转化载体pK18mobsacB得到重组质粒pK18-wza-UKD。将重组质粒自然转化入HPS FX0103中,通过kan抗性筛选得到wza基因缺失突变株FX0103-△wza,并对突变株用PCR、 RT-PCR、Southern Blot及Western Blot进行了鉴定。 2、HPS野生株FX0103与缺失株FX0103-△wza的生物学特性的比较 将FX0103与FX0103-△wza培养24h并绘制生长曲线,结果表明缺失wza之后不影响菌株的生长。透射电子显微镜观察表明缺失株的荚膜比野生株薄。对细菌的总多糖和细胞外多糖进行了提取,发现缺失株总多糖含量高于野生株,而缺失株的胞外多糖却比野生株少。血清分型试验结果表明3个稀释度下野生株FX0103仍有较强的沉淀线而缺失株FX0103-△wza的沉淀线已经很弱甚至消失。该结果说明荚膜多糖输出蛋白可能与其血清分型有关。 3、HPS荚膜多糖输出蛋白与粘附相关 将野生株和wza基因缺失株与长至单层的猪肾上皮细胞(PK-15)互做,发现缺失株FX0103-△wza的粘附能力比野生株FX0103强,并且在90min时二者的粘附能力达到最大。分析缺失株FX0103-△wza的粘附能力增强的原因可能是破坏细菌的荚膜多糖输出蛋白之后暴露了一些与宿主细胞作用的结合位点,从而使更多的菌粘附到了细胞表面。 4、HPS荚膜多糖输出蛋白与细菌的抗吞噬能力相关 将tiPS野生株FX0103和缺失株FX0103-△wza与长至单层的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)相互作用,结果表明野生株FX0103抗小鼠单核巨噬细胞的能力比缺失株FX0103-△wza强。比较野生株与缺失株的胞内存活能力,发现随着时间的延长,野生株FX0103和缺失株FX0103-△wza的胞内存活率有明显的差别,缺失株FX0103-△wza的存活率明显比野生株低。


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