收藏本站
《华中农业大学》 2014年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

地衣素高产地衣芽胞杆菌工程菌的构建及地衣素对聚γ-谷氨酸合成的影响

邱一敏  
【摘要】:生物表面活性剂,除具有表/界面活性,其独有的低毒或无毒性和环境相容性等特性,使其在石油工业、医药、化妆品、食品加工等领域开始逐步替代化学表面活性剂。脂肽表面活性剂地衣素(lichenysin)具有较强的表面活性、溶血活性和离子螯合性,但由于其得率低、生产成本高,限制了它的大规模工业化生产与应用推广。为提高lichenysin的发酵产率、降低生产成本,本研究以实验室前期选育的地衣芽胞杆菌WX-02为研究对象,考察不同启动子对lichenysin生物合成的影响;构建lichenysin高产工程菌株,并对其发酵工艺进行优化,提高lichenysin产量。同时,在发现地衣素诱导WX-02高产聚γ-谷氨酸(poly-y-glutamic acid,以下简称γ-PGA)的基础上,利用代谢通量分析方法,结合关键酶基因表达差异分析,考察了lichenysin合成量对地衣芽胞杆菌y-PGA合成的代谢调节,并探讨了lichenysin促进γ-PGA合成的可能机制。主要结论如下:1.地衣芽胞杆菌WX-02表面活性物质地衣素的分离纯化及结构分析结合GC-MS和电喷雾质谱(ESI-MS),解析地衣芽胞杆菌WX-02产生的脂肽化合物的结构:它是由[M+H]+m/z分别为993.6、1007.9、1021.9、1035.9和10499的lichenysin同系物组成, 其肽链氨基酸基本序列为Glnl-Leu2-Leu3-Val4-Asp5-Leu6-Ile7:碳链长度在C12至C16之间。其中,[M+H]+m/z1007.9,1035.9这2种分子结构组分分别由2个同分异构体组成,其碳链中第7位氨基酸为11e或Val。2.地衣素高产地衣芽胞杆菌工程菌株的构建通过同源重组,将来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43(组成型)、启动子Psrf(surfactin合成操纵子启动子)和地衣芽胞杆菌WX-02的启动子Pxyt(木糖诱导型),分别替代地衣芽胞杆菌WX-02中lichenysin合成操纵子的原始启动子Plch,构建lichenysin工程菌地衣芽胞杆菌WX02-P431ch、WX02-Psrflch和WX02-Pxyllch。以无lichenysin合成能力的缺失株WX02-ΔlchAC作负对照,对比lichenysin工程菌和原始菌WX-02的lichenysin合成量,结果表明地衣芽胞杆菌WX02-P431ch和WX02-Psrflch的lichenysin最高产量分别为225 mg/L和779 mg/L,较原始菌分别提高了0.9倍和5.5倍。而WX02-Pxyllch的lichenysin产量仅为45 mg/L,较原始菌降低了63%。通过qRT-PCR检测重组菌与原始菌的lichenysin合成酶LchAA编码基因lchAA的转录水平,结果显示lchAA的表达量与菌株的lichenysin合成量变化趋势一致,表明lichenysin生物合成操纵子在不同强度的启动子控制下发生差异性表达,进而影响lichenysin的合成量。通过比较重组菌与原始菌的群游和生物被膜形成能力,进一步验证了工程菌的lichenysin生产能力。3.地衣素高产工程菌WX02-Psrflch的摇瓶发酵工艺优化利用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究各种营养成分和环境因素对lichenysin高产工程菌WX02-Psrflch摇瓶发酵生产lichenysin的影响。结果表明,葡萄糖是lichenysin合成的最适碳源,无机氮源比有机氮源更有利于lichenysin的合成,Na2HPO4-KH2PO4缓冲体系对WX02-Psrflch发酵生产lichenysin十分重要。优化后的培养基组成为:30 g/L glucose,5 g/L NH4NO3,60 mmol/L KH2PO4,80 mmol/L Na2HPO4,0.4 mmol/L FeSO4·7H2O,0.2 mmol/L MnSO4-H2O,0.8 mmol/L MgSO4·7H2O,7 nmol/L CaCl2,4 Mmol/LNa2-EDTA;最佳摇瓶发酵条件为:培养温度37℃、种龄8 h、接种量(v/v)3%、装液量为30 mL/250 mL三角瓶。在优化的发酵工艺下,WX02-Psrflch的lichenysin产量可达到2149 mg/L,较原始菌WX-02提高了16.8倍。4.地衣素对地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸合成的影响考察外源添加lichenysin对原始菌WX-02及缺失株WX02-ΔlchAC发酵生产γ-PGA的影响,发现一定浓度的lichenysin促进WX-02和WX02-ΔlchAC合成γ-PGA。比较lichenysin工程菌和原始菌的γ-PGA生产水平,结果表明细菌自身的lichenysin合成能力显著影响其γ-PGA发酵水平,γ-PGA产量与lichenysin合成量正相关。以原始菌(WX-02)、lichenysin高产株(WX02-Psrflch)和lichenysin不产工程菌(WX02-MchAC)作为研究对象进行γ-PGA发酵,发现WX02-Psrflch的γ-PGA最大产量达到43.6 g/L,分别是WX-02和WX02-ΔlchAC的1.2倍和1.5倍。分析三株菌的γ-PGA发酵过程曲线,发现在γ-PGA合成过程中,地衣素可能通过增强细菌对底物和储备碳源乙偶姻的利用能力,削弱对发酵副产物的合成能力,从而促进菌体生长及y-PGA合成。代谢流分析结果表明,lichenysin能促使细胞内的代谢流发生迁移,减弱了溢流代谢途径的代谢通量,增强能量合成和三羧酸循环(TCA循环)的代谢通量,使更多的碳流流入谷氨酸合成途径,进而推动y-PGA的合成。进一步考察地衣素对γ-PGA合成代谢途径中关键酶基因的转录水平的影响,qRT-PCR结果显示:在γ-PGA合成代谢途径中,关键酶基因的表达量与代谢通量变化趋势大致相符,这也从基因表达水平验证了代谢网络中关键节点处的流量分配变化。此外,通过比较分析lichenysin合成与γ-PGA生物合成相关调控蛋白基因的表达水平发现,与原始菌WX-02相比,在lichenysin高产菌中与lichenysin和γ-PGA合成相关的正调控因子如ComA、DegQ和DegU等的转录量显著提高,因而促进了γ-PGA合成酶基因pgsB的表达.上述结果表明,在地衣芽胞杆菌lichenysin工程菌株中lichenysin的合成受到启动子强度的作用。而在γ-PGA发酵过程中,lichenysin通过影响γ-PGA合成代谢途径的代谢通量和关键酶基因的表达,以及γ-PGA生物合成相关调控蛋白基因的转录水平,进而影响地衣芽胞杆菌的γ-PGA合成能力。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:TQ920.1

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
1 王英武,王玲,顾景凯,陈刚,钟大放,周慧;电喷雾-串联四极杆-飞行时间质谱法分析寡肽的一级结构[J];分析化学;2003年06期
2 温琦;刘登如;陈坚;堵国成;;添加表面活性剂促进兽疫链球菌高产透明质酸[J];化工进展;2006年09期
3 唐胜球;董小英;邹晓庭;;微生物脂肽的研究概况[J];黑龙江畜牧兽医;2007年05期
4 胡丽芳;李欣;冀志霞;陈守文;;地衣芽胞杆菌WX-02补糖发酵聚γ-谷氨酸的工艺优化[J];华中农业大学学报;2012年03期
5 张宁,傅亮,彭志英;表面活性剂对土壤杆菌Q9415发酵产胶的影响[J];食品科学;2004年05期
6 崔艳华;曲晓军;董爱军;丁忠庆;;细菌群体感应系统的研究[J];生物技术通报;2009年04期
7 谷利伟,谷文英,陶冠军,秦昉;HPLC-ESI/MS法分析大豆胚芽中的异黄酮——大豆异黄酮和皂苷的研究(Ⅲ)[J];中草药;2000年11期
8 孙力军;陆兆新;别小妹;吕凤霞;方传记;;培养基对解淀粉芽孢杆菌ES-2菌株产抗菌脂肽的影响[J];中国农业科学;2008年10期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 雍晓雨;解淀粉芽孢杆菌C1-6固体发酵生产γ--多聚谷氨酸的工艺及技术研究[D];南京农业大学;2012年
2 田光明;地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶和聚γ-谷氨酸降解酶的研究[D];华中农业大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 吕传娟;生物法生产手性乙偶姻及(2S,3S)-2,3-丁二醇的研究[D];山东大学;2009年
2 刘玉玲;枯草芽孢杆菌nja-9理化诱变及SubtilosinA的结构鉴定[D];南京农业大学;2012年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汪莞;赵平生;周涛;王子迎;;大豆疫霉拮抗细菌B048液体发酵培养基的筛选与发酵条件的优化[J];合肥师范学院学报;2011年06期
2 车晓曦;李校堃;;解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究进展[J];北京农业;2010年03期
3 肖怀,陈泽乃,陆阳,顾雅芳,谢一凡,王卓;HPLC测定槐角中槐苷含量[J];大理学院学报;2003年03期
4 白进发,刘志强,刘宁,刘淑莹,姬志鹃,盛树力;合成多肽的电喷雾质谱研究[J];分析化学;2005年05期
5 蒋菁莉;徐彦军;娄飞;任发政;;反相高效液相色谱-电喷雾质谱法分析食源血管紧张素转换酶抑制肽[J];分析化学;2007年03期
6 许美玲;卫云路;鲁伟健;黄小苑;郑成;;表面活性剂作为糖蜜发酵谷氨酸促发剂的研究[J];广东化工;2008年12期
7 赖闻玲,陈京才;液相色谱-电喷雾电离质谱法及其应用[J];赣南师范学院学报;2001年06期
8 郭静;李慕岩;孙朋;刘涛;王雀;邓少丽;;细菌群体感应及其研究进展[J];国际检验医学杂志;2012年01期
9 肖坤福,廖晓峰,于荣,梁华正;黄酮类化合物研究进展[J];广州食品工业科技;2003年03期
10 吴一晶;林艺芬;林河通;陈艺晖;陈梦茵;姜萍;;生防菌解淀粉芽孢杆菌研究进展[J];包装与食品机械;2012年06期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈永浩;透明质酸发酵法制备及其复合改性研究[D];江南大学;2010年
2 刘金龙;微生物发酵法制备聚唾液酸的研究[D];江南大学;2011年
3 曹云;SQR 9微生物有机肥防治黄瓜土传枯萎病的效应与机制研究[D];南京农业大学;2011年
4 罗晓健;复方丹参多层缓释片及其体内外评价方法的研究[D];沈阳药科大学;2001年
5 葛喜珍;卵巢切除大鼠主动脉晚期糖化终末产物和血脂的变化及大豆异黄酮的干预作用[D];河北医科大学;2003年
6 袁怀波;葛根总黄酮致人白血病细胞凋亡的效应研究[D];西南农业大学;2004年
7 黄兰芳;联用色谱在中药和生物样本中活性成分的分析方法及其应用研究[D];中南大学;2004年
8 朱晓红;尾叶香茶菜化学及生物活性成分研究[D];华东师范大学;2008年
9 袁晓晴;癞葡萄降血糖肽的制备及其降糖机理研究[D];江南大学;2007年
10 刘龙;兽疫链球菌发酵生产透明质酸过程控制与优化[D];江南大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘陆;氘代氨基酸的制备及其在脂肽生物合成中的应用[D];华东理工大学;2011年
2 索雅丽;辣椒疫霉病生防芽孢杆菌快速筛选及菌株B006的代谢活性物质研究[D];河北农业大学;2011年
3 尤翠萍;发酵法生产木糖醇中重要中间产物的发酵条件的研究[D];江南大学;2011年
4 张艳;大豆异黄酮测定方法的优化及大豆F3H基因沉默表达载体的构建[D];吉林大学;2011年
5 王影;萌发绿豆中总黄酮含量的动态变化及其抗氧化功效研究[D];吉林农业大学;2011年
6 陈孝武;液相色谱—质谱联用技术在食品安全分析中的应用[D];郑州大学;2011年
7 李娜;高效液相色谱—质谱联用在药物分析中的应用[D];中国科学技术大学;2011年
8 魏浩;淀粉液化芽孢杆菌ES-2抗菌脂肽生产工艺的研究[D];南京农业大学;2011年
9 石冬冬;大豆异黄酮的提取纯化工艺及其抗氧化性的研究[D];东北农业大学;2002年
10 井乐刚;大豆乳清中大豆异黄酮的提取纯化及其生物活性的研究[D];东北农业大学;2003年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 梁慧星;;离子注入技术在微生物诱变育种中的研究[J];安徽农业科学;2007年09期
2 孙建利;;对过量使用化肥危害的思考[J];现代农业科技;2010年16期
3 汪家铭;;聚γ-谷氨酸增效复合肥的发展与应用[J];川化;2010年02期
4 高定;陈同斌;刘斌;郑袁明;郑国砥;李艳霞;;我国畜禽养殖业粪便污染风险与控制策略[J];地理研究;2006年02期
5 钟敏;童孝田;孙宇辉;涂国全;吴厚铭;;链霉菌702所产抗细菌组分S2的化学结构鉴定[J];福建农林大学学报(自然科学版);2007年03期
6 钟希琼,王惠珍,邓日烈,上官国莲,林丽超;生物有机肥对蔬菜生理性状和品质的影响[J];佛山科学技术学院学报(自然科学版);2005年02期
7 李国琛;王颜红;吴仁安;王世成;;HPLC与MALDI-TOF MS联用技术分析蛋黄中的磷脂[J];分析试验室;2009年04期
8 朱金勇,黄河清;MALDI-TOF质谱技术分析细胞与组织多肽组成的研究进展[J];分析仪器;2004年02期
9 方传记;陆兆新;孙力军;吕凤霞;别小妹;;低能N~+离子注入选育抗菌脂肽高产菌及其发酵的研究[J];辐射研究与辐射工艺学报;2006年06期
10 郭朝江;乔红群;李莎;李会;徐虹;;低能N~+注入诱变选育威兰胶高产菌的研究[J];辐射研究与辐射工艺学报;2007年05期
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 惠明;枯草芽孢杆菌B53的分离鉴定及产聚γ-谷氨酸的研究[D];中国农业大学;2005年
2 陈雄;枯草芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸及其应用研究[D];华中农业大学;2005年
3 李自刚;农业有机固体废弃物堆肥过程中微生物多样性与物质转化关系研究[D];南京农业大学;2006年
4 孙力军;植物内生菌Bacillus amyloliquefaciens ES-2的分离筛选及其抗菌物质的研究[D];南京农业大学;2006年
5 王启军;枯草芽胞杆菌B6-1产脂肽和聚-γ-谷氨酸及抗几种植物病原菌的研究[D];华中农业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 杨俐;贵州绿僵菌产壳聚糖酶的纯化鉴定及高产菌株的诱变选育[D];四川大学;2007年
2 王嫱;高聚合粘度γ-多聚谷氨酸产生菌的诱变筛选及其水凝胶的制备和研究[D];四川大学;2007年
3 谢凝子;产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌Tx26的筛选及基因在大肠杆菌中的表达[D];华中农业大学;2008年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 施大林;孙梅;潘良坤;刘淮;胡凌;陈秋红;张维娜;匡群;;地衣芽胞杆菌培养条件的研究[J];微生物学杂志;2009年05期
2 刘金平;于晶晶;牛福星;滕昆;覃晓丽;韦宇拓;;地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶产麦芽糖特性研究[J];广西科学院学报;2013年03期
3 付军涛;祁高富;刘军;冀志霞;马昕;陈守文;;两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果[J];应用与环境生物学报;2012年03期
4 赵恕;张娅楠;袁杰利;;地衣芽胞杆菌对白色念珠菌等的拮抗作用[J];中国微生态学杂志;2008年03期
5 王义良;罗进贤;胡晋新;李文清;;地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因的克隆及其表达[J];中山大学学报论丛;1992年03期
6 许发芝;李吕木;徐子伟;张志才;;地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性[J];中国微生态学杂志;2011年07期
7 王丽华;;高湿度对地衣芽胞杆菌胶囊质量的影响[J];生物技术通讯;2014年01期
8 刘柏宏;张娟;方真;刘文涛;堵国成;陈坚;廖祥儒;;来源于地衣芽胞杆菌的角蛋白酶在大肠杆菌中的表达、理化性质及其发酵优化[J];应用与环境生物学报;2013年06期
9 熊欢;魏雪团;冀志霞;孙明;陈守文;;透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达[J];微生物学通报;2008年11期
10 杨艳华;牛丹丹;石贵阳;王正祥;;过量表达DegQ有利于地衣芽胞杆菌表达高温α-淀粉酶[J];微生物学杂志;2009年02期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 杨汉博;周安国;杨凤;;地衣芽胞杆菌BL15和BL19对黄鸡肠道微生物影响的研究[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第六次学术研讨会论文集[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 王润华;腹胀病因多 用药细斟酌[N];家庭医生报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 邱一敏;地衣素高产地衣芽胞杆菌工程菌的构建及地衣素对聚γ-谷氨酸合成的影响[D];华中农业大学;2014年
2 李欣;硝酸盐还原作用对地衣芽胞杆菌合成聚γ-谷氨酸的影响分析[D];华中农业大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 彭亚林;印度洋深海热液区盐单胞菌和地衣芽胞杆菌的筛选、鉴定及生理生化特性研究[D];中国海洋大学;2008年
2 胡胜兰;高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的菌种选育[D];华中农业大学;2010年
3 魏雪团;耐盐地衣芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸的发酵工艺优化及环境压力冲击对发酵的影响[D];华中农业大学;2009年
4 鲍帅帅;地衣芽胞杆菌产杆菌肽的代谢及工艺优化研究[D];湖北工业大学;2014年
5 计坚;地衣芽胞杆菌代谢组学样品制备方法的建立及环境因素对其生物合成γ-PGA的影响[D];华中农业大学;2010年
6 熊欢;透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达[D];华中农业大学;2008年
7 袁润;地衣芽胞杆菌木糖利用代谢工程[D];华中农业大学;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026