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《华中农业大学》 2015年
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PRRSV Nsp11单克隆抗体制备及蛋白质组学研究

刘德志  
【摘要】:由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)给世界养猪业造成了巨大的经济损失。当PRRSV感染宿主时,猪的体内会产生I型干扰素(I-IFN)来抵抗PRRSV的入侵,与此同时,病毒进化出一系列逃避宿主免疫监视的机制,达到免疫逃避的目的,目前免疫抑制机制尚不明确。PRRSV非结构蛋白11(Nsp11)在抑制I-IFN产生的过程中扮演重要角色,但参与天然免疫其他信号通路过程了解甚少。本研究利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达具有细胞毒性的PRRSV Nsp11,并制备了Nsp11单克隆抗体;进一步通过i TRAQ蛋白质组学技术鉴定出PRRSV Nsp11引起宿主1.2倍差异表达蛋白434个,流式细胞术及Western Blot实验说明Nsp11能够引起PAM 3D4/21细胞内质网应激,进而诱导细胞凋亡。主要研究如下:1.PRRSV Nsp11的表达及纯化为了优化PRRSV Nsp11在大肠杆菌中的表达条件,将p ET-30a-Nsp11原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导,并于诱导后不同时间点取样进行检测,结果以37℃、0.2 m M IPTG诱导30min的表达效果最佳,并且表达蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为32 k Da。经Ni-NTA柱纯化,获得浓度为0.6mg/m L的纯化蛋白。2.PRRSV Nsp11单克隆抗体的制备将纯化后的Nsp11蛋白作为免疫原,免疫六周龄雌性BALB/C小鼠,经过细胞融合、ELISA筛选及细胞克隆,共获得8株稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1、1C10、5B11,IFA及Western Blot实验证实其中6株(1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1)能与PRRSV Nsp11发生特异性反应。3.PRRSV Nsp11的亚细胞定位将PRRSV接种Marc-145细胞,于接种后不同时间点(6h、12h、24h、36h、48h)分别取样,以PRRSV Nsp11单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠Ig G为二抗进行间接免疫荧光实验,结果PRRSV感染时间的延长,Nsp11的表达量逐渐增加,但在不同时间点均呈胞浆定位。4.PRRSV Nsp11蛋白质组学数据分析蛋白质组学能在生物整体水平进行高通量检测分析,本研究利用Nsp11重组慢病毒感染PAM 3D4/21细胞,经i TRAQ蛋白质组学处理分析后,共鉴定到蛋白5023个,引起1.2倍差异表达蛋白434个,其中上调表达蛋白184个,下调表达蛋白250个。利用Western Blot对2个上调表达蛋白CAPN2和AAMP及1个下调表达蛋白CD63进行分析,结果与蛋白质组学数据一致,从而证实了蛋白质组学数据的可靠性。5.PRRSV Nsp11引起内质网应激而导致细胞凋亡Caspase3是引起细胞凋亡的关键效应分子,蛋白质组学和Western Blot验证了PRRSV Nsp11能够上调caspase3的表达及活化。流式细胞术实验说明,PRRSV Nsp11能够上调PAM 3D4/21细胞凋亡比率,双荧光素酶实验同时发现Nsp11能够引起由内质网应激导致细胞凋亡关键分子CHOP的上调表达,Western Blot检测到PRRSV Nsp11促进了GRP78、GRP94伴侣分子的上调表达以及e IF2α磷酸化,说明PRRSV能够引起PAM 3D4/21细胞内质网应激。PRRSV感染宿主细胞过程中能够激活JNK信号通路引起细胞凋亡,Western Blot结果发现PRRSV Nsp11能够促进JNK的磷酸化,说明PRRSV Nsp11引起内质网应激而导致细胞凋亡。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S858.28

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