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甘蓝型油菜每角粒数主效QTL qSS.C9的克隆和功能研究

李世鹏  
【摘要】:甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物之一。提高油菜产量一直是油菜育种的重要目标。每角粒数、千粒重和单株角果数是构成油菜单株产量的三大因素。近些年来,大量有关产量性状QTL定位的结果被报道,其中有35个是每角粒数相关QTLs。但是,到目前为止,尚无每角粒数性状相关QTLs被克隆的报道。张立武(2010)利用每角粒数较少的品系HZ396和每角粒数较多的品系Y106构建了一个包括140份株系的DH群体,通过三年两地的QTL检测,检测到一个每角粒数主效QTL qSS.C9,该位点平均解释了57.77%的表型变异。本研究在前人的研究基础上成功构建了以HZ396为遗传背景的qSS.C9位点的近等基因系(NIL),并通过两个定位群体实现了qSS.C9位点的精细定位。采用图位克隆和比较基因组学相结合的方法成功分离了qSS.C9基因。同时,利用细胞学和分子生物学的方法,阐述了HZ396胚珠败育的机理和BnaC9.SMG7b基因的功能。主要结果如下:1.高世代群体中qSS.C9位点的遗传效应分析。通过连续回交的方式构建了以Y106为供体亲本,HZ396为轮回亲本的qSS.C9位点的BC3F2分离群体。利用该群体对qSS.C9位点进行的遗传分析表明,该位点解释了每角粒数61.9%的表型变异,加性效应为7.4粒,显性效应为6.4粒。2.qSS.C9的精细定位。我们分别以Y106和W11为供体亲本,HZ396为轮回亲本构建了两个定位群体。两个群体分别包括16,466和1,088个单株,共计17,554个单株。利用标记SCC9-136、SRC9-298和SRC9-397对这两个定位群体进行分析,将qSS.C9基因限定在对应白菜A10染色体上约140 kb的区间内,对应甘蓝C9染色体上约280 kb的区间内,对应甘蓝型油菜C9染色体上约261 kb的区间内。3.qSS.C9的克隆。根据甘蓝数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php),定位区间内包含45个候选基因。我们根据基因注释选取了其中的29个候选基因在NIL(HZ396)和NIL(Y106)中进行了比较测序。结果发现,29个候选基因中有2个候选基因在NIL(HZ396)中缺失,分别为对应甘蓝的同源基因Bol043637和Bol043640,其余27个候选基因在NILs之间序列无差异。通过遗传转化实验最终确定,与拟南芥AtSMG7(At5g19400)同源的BnaC9.SMG7b是qSS.C9的目的基因。4.BnaC9.SMG7b的进化分析。SMG7的进化树、序列一致性和十字花科微观共线性分析表明,bnac9.smg7b在进化上起源于bolc9.smg7b。bnac9.smg7b的单倍型分析表明,单倍型i中bnac9.smg7b基因缺失,单倍型ii、iii和iv中的snp位点不改变氨基酸的编码。t测验表明,单倍型i与单倍型ii、iii和iv的每角粒数之间均存在显著性差异,而单倍型ii、iii和iv之间每角粒数不存在显著性差异。单倍型分析结果表明bnac9.smg7b位点经历了明显的人工选择过程。5.bnac9.smg7b对产量的影响。通过对nil(hz396)和nil(y106)6个产量相关性状(每角粒数、千粒重、单株角果数、角果长、一次有效分枝数和单株产量)分析表明,nil(y106)中每角粒数显著增加而千粒重和单株角果数明显下降。由于每角粒数的显著性增加最终导致nil(y106)的单株产量增加了58.7%。上述结果表明bnac9.smg7b基因对油菜单株产量起着重要的作用。6.bnac9.smg7b和bnac9.smg7c的表达分析。rt-pcr、qpcr和启动子分析结果表明bnac9.smg7b在开花前后的子房、叶片和花梗中表达,在雄蕊、花瓣、茎和成熟的角果中不表达,而rt-pcr和qpcr分析表明,bnac9.smg7c在各组织中均表达。亚细胞定位表明,bnac9.smg7b和bnac9.smg7c均定位在细胞器p小体内。7.bnac9.smg7b的功能研究。胼胝质染色表明,nil(hz396)和nil(y106)中减数分裂过程中的二分体到四分体时期的大孢子母细胞均发育正常。激光共聚焦显微镜观察表明,nil(hz396)中65.6%的大孢子母细胞未形成正常的功能大孢子,这一比例与nil(hz396)最终的胚珠败育率(69.8%)相似。rna-seq分析表明,大多数已知的调控减数分裂周期进程的相关基因在nil(hz396)中显著下调表达。而拟南芥同源基因atsmg7参与调控细胞周期退出第二次减数分裂的过程。综上所述,我们认为bnac9.smg7b在大孢子母细胞减数分裂过程中的作用与拟南芥同源基因atsmg7的功能一致。而bnac9.smg7b不在雄蕊中表达且nil(hz396)花器官发育正常、花粉可育。因此,我们认为bnac9.smg7b不参与调控小孢子母细胞减数分裂过程。通过对rna-seq数据分析表明,可变剪切事件在nils之间不存在显著性差异。进一步对油菜单拷贝基因bnaa03g28670d的+/-ptc转录本的表达量分析表明,nil(hz396)中+ptc转录本表达量并未异常增加,且nil(hz396)植株发育正常。bnac9.smg7b拟南芥突变体smg7-3遗传转化实验表明,bnac9.smg7b不能恢复smg7-3突变体的表型,且+PTC转录本(At2g45670)的表达量也依然异常。综上所述,我们认为BnaC9.SMG7b不参与无义突变介导的mRNA降解途径(NMD)。


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