收藏本站
《华中农业大学》 2016年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

泛素特异性蛋白酶USP15调控Ⅰ型干扰素的机制研究以及PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学

张欢  
【摘要】:泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是指单个或多个泛素分子连接到目标蛋白赖氨酸(Lys)残基上的修饰过程,需要E1泛素激活酶、E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶的共同参与。在细胞生命过程中起着重要调控作用,涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、蛋白相互作用以及信号转导等方面。干扰素(IFN)是宿主抗病毒感染的重要防御机制,也是当前抗病毒天然免疫研究的重点。I型干扰素表达异常会引发相关的免疫疾病,因此严格调控I型干扰素对于维持机体的免疫稳态十分重要。泛素化作为一种热门并且关键的翻译后修饰,在干扰素产生及其信号转导中扮演着关键角色。泛素特异性蛋白酶(USPs)是家族成员数目最多的去泛素化酶(DUBs),正受到广泛的关注,其功能和结构因家族成员众多而存在多样性。本实验以USP15作为研究对象,深入探究其在调节I型干扰素信号通路中的作用,为扩充USPs家族的生物学功能提供理论基础。泛素化修饰不仅调节细胞内多项生理功能,还参与调控多种病毒的复制与增殖过程,如牛病毒性腹泻病毒基因组有泛素和类泛素基因;轮状病毒等利用泛素蛋白酶体途径调节自身复制;人免疫缺陷病毒等编码蛋白可以发生泛素化修饰;流感病毒等通过编码具有E3泛素连接酶活性的蛋白或者其他途径调控细胞内蛋白的泛素化修饰。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害当前养猪业的重要病原,其免疫机制十分复杂。目前关于泛素化修饰在PRRSV感染与免疫中的作用尚不清楚。因此本研究利用蛋白质组学技术对PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)前后泛素化修饰进行了定量分析,揭示泛素化修饰在PRRSV感染与致病性方面发挥的重要作用。具体研究内容如下:1.泛素特异性蛋白酶USP15调控I型干扰素的机制研究在我们前期通过siRNA筛选调控干扰素的泛素特异性蛋白酶时,发现干扰USP15后可以上调ISRE启动子活性,因此对其进行进一步研究。干扰分子干扰内源性USP15基因后仙台病毒诱导的IFN-β表达(启动子水平,mRNA水平以及蛋白水平)、IRF3和NF-κB启动子活性及磷酸化修饰、ISRE启动子活性及干扰素刺激基因(ISGs)的表达都有明显上调,而在细胞内超表达USP15后则呈现显著的抑制效果。此外,我们还通过观察对干扰素高度敏感的水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)的增殖情况,证实超表达USP15可以显著抑制干扰素的产生。进一步的体外及体内去泛素实验证实USP15具有去泛素活性且活性位点是第269位C(半胱氨酸)及862位H(组氨酸)。免疫共沉淀实验发现,USP15可以特异性去除RIG-I K63形式偶联的多聚泛素。通过分析USP15的突变体,发现USP15 DUB活性位点突变后其抑制IFN-β活性的能力显著降低但并未完全丧失,表明USP15抑制干扰素产生需要但不完全依赖其DUB活性。同时,我们还发现USP15可以与RIG-I直接相互作用,并且竞争性抑制RIG-I对IPS-1的募集,而且DUB活性位点突变的USP15突变体同样可以通过与RIG-I发生相互作用进而减弱RIG-I与IPS-1之间的结合,进一步证实USP15可以通过不依赖去泛素化活性的方式抑制干扰素产生。因此,USP15可以通过两种不同的机制抑制干扰素产生及其信号通路:(1)USP15特异性去除RIG-I K63形式连接的多聚泛素;(2)USP15竞争性抑制RIG-I对IPS-1的募集作用。2.PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学将PRRSV WUH3株感染猪原代肺泡巨噬细胞,于感染后36 h收集被感染细胞,利用Label-free技术,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对PRRSV感染细胞泛素化修饰的变化情况进行检测和分析。共鉴定出315个蛋白的431个泛素化位点修饰显著上调,402个蛋白的552个泛素化位点修饰显著下调。通过生物信息学技术对修饰存在显著差异蛋白的亚细胞定位、生物学功能、KEGG代谢通路等进行分析,发现修饰显著差异蛋白与蛋白酶体降解、蛋白定位以及能量代谢等多种生物进程相关,并且发生泛素化修饰的motif有3种,分别为:Kub XXP、RXXXXLXKub和KubQ。将PRRSV WUH3株感染PAM细胞后的差异蛋白质组学与泛素化修饰组学进行关联分析,证实泛素化修饰与蛋白表达量之间没有明显的关联。通过对修饰存在显著差异蛋白的生物学功能进行深入分析,发现许多蛋白与干扰素信号通路、NF-κB信号通路相关,如TRAF6、IL-1β、HMGB1、JAK1、Mx2以及ISG15等,表明泛素化修饰的改变在PRRSV调控干扰素及炎症反应中起到了关键作用。同时,我们还发现PRRSV编码的15种蛋白(nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、ORF2a、ORF3、ORF5、ORF6、ORF7)的64个位点存在泛素化修饰,包括参与RNA合成、诱导中和抗体产生以及决定病毒感染力的非结构蛋白与结构蛋白,而且我们还发现泛素蛋白酶体途径抑制剂处理PAM细胞后PRRSV的增殖受到明显抑制,提示泛素化修饰可能在PRRSV的转录、复制以及蛋白合成中发挥作用。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;动物所有关泛素链形成机制研究取得新进展[J];江西饲料;2014年01期
2 陈季武;郑丽娜;王帮正;李晓涛;;泛素化介导的非蛋白质降解功能[J];生物化学与生物物理进展;2012年07期
3 瞿苏;王友群;;泛素非经典通路的研究[J];医学综述;2006年17期
4 何冰;宋晓峰;;基于蛋白质序列的泛素化位点预测研究进展[J];现代生物医学进展;2012年18期
5 卢亮;李栋;贺福初;;蛋白质泛素化修饰的生物信息学研究进展[J];遗传;2013年01期
6 吕永坤;周景文;刘龙;;氮代谢调控相关蛋白质泛素化修饰筛选[J];食品与生物技术学报;2014年06期
7 陈雨晗;张令强;贺福初;;去泛素化酶与基因表达调控[J];生物化学与生物物理进展;2014年02期
8 喻海燕;宋晓峰;;蛋白质泛素化位点单核苷酸多态性的研究进展[J];计算机与应用化学;2014年02期
9 杜秋丽;李莉;;植物泛素化系统[J];济宁学院学报;2011年03期
10 宋春雷;刘红林;;组蛋白的泛素化与去泛素化修饰[J];细胞生物学杂志;2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 艾永兴;赵程程;郑海南;吴山力;张玉静;;病毒编码的泛素化酶与去泛素化酶的研究进展[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年
2 丰蕾;李德峰;王大成;;杨树菇泛素接合酶E2(UbcA1)的晶体结构研究[A];中国晶体学会第四届全国会员代表大会暨学术会议学术论文摘要集[C];2008年
3 徐辉明;;Wwp2催化转录因子Oct-4的泛素化修饰[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
4 赵程程;郑海南;吴山力;吴涵;张玉静;艾永兴;;UAF1与去泛素化酶USP家族相互作用的研究进展[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年
5 张浩;李玮妮;陈立涵;韩白玉;程龙;徐小洁;叶棋浓;;ERbeta类泛素化修饰及其生物学意义[A];生命的分子机器及其调控网络——2012年全国生物化学与分子生物学学术大会摘要集[C];2012年
6 李亭亭;关俊宏;郑晓峰;;组蛋白的Neddylation拮抗泛素化并参与DNA损伤修复的调控[A];细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉论文摘要集[C];2013年
7 廖兵;;Wwp2呈剂量依赖性调节Oct-4的泛素化修饰[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
8 李志强;张浩;张根堂;于如同;;脑胶质瘤中NEDD4-1调节鸟苷酸交换因子CNrasGEF泛素化作用的研究[A];2011中华医学会神经外科学学术会议论文汇编[C];2011年
9 高明;李小光;董雯;金蕊;马航航;杨平勋;胡美茹;李译;郝一;宋伦;;核糖体小亚基蛋白S7通过调控MDM2依赖GADD45泛素化降解反应介导砷化物诱导的促细胞凋亡效应[A];中国毒理学会第六届全国毒理学大会论文摘要[C];2013年
10 李永涛;吴舒娟;钱伟;金梅林;;HSP27通过K48泛素化途径降解TRAF3蛋白负调控Ⅰ型干扰素信号通路[A];细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉论文摘要集[C];2013年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 李婵;“钻”进细胞的人[N];北京科技报;2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王慧;去泛素化酶CYLD通过下调Nrf2调节心脏重构和功能障碍[D];山东大学;2015年
2 周紫章;Usp7/HAUSP通过去泛素化Ci/Gli调控Hh信号通路[D];南京大学;2015年
3 郭曰帅;精子发生相关泛素化修饰的蛋白质组学研究[D];南京医科大学;2015年
4 张还添;PRMT5的转录调控及其泛素化-蛋白酶体降解机制研究[D];暨南大学;2015年
5 谢鑫;稻瘟菌效应蛋白MoNLE1的功能分析和水稻泛素化蛋白质组学研究[D];中国农业大学;2016年
6 王建敏;去泛素化酶USP13酶活性研究及2D-DIGE在USP13调控的蛋白分子筛选中的应用[D];河北医科大学;2016年
7 杨燚;内质网E3泛素化连接酶Hrd1在B细胞发育和活化中的作用及机制研究[D];苏州大学;2016年
8 卢亮;泛素化修饰位点的生物信息学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年
9 何珊;线性泛素链组装复合体LUBAC与泛素连接酶Smurfs相互作用与调控机制的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年
10 葛菲;ATXN3L通过去泛素化KLF5促进乳腺癌增殖[D];重庆医科大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 游含宇;CKS对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的调控作用[D];福建医科大学;2015年
2 冯志霞;UCH-L1对HDAC6介导的tau蛋白功能性聚集体形成的影响[D];华中师范大学;2015年
3 李洪昌;抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3转基因小鼠模型的建立及表型分析[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年
4 李洁;UBE2O在c-Maf泛素化降解过程中的功能研究[D];苏州大学;2015年
5 陈静静;去泛素化酶对PTEN蛋白稳定性调控的研究[D];安徽医科大学;2015年
6 郭赛赛;PIM1激酶线性泛素化修饰及其功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年
7 于素;E3泛素连接酶FBW7对KLF10蛋白稳定性调控及生物学功能的研究[D];华东师范大学;2013年
8 程晓牧;USP15、USP21抑制剂筛选及去泛素化酶活性检测系统改进[D];华东师范大学;2015年
9 魏洁;泛素连接酶RNF152通过促进小G蛋Rheb的泛素化从而抑制mTORCl活性的相关研究[D];华东师范大学;2014年
10 姜尚文;去泛素化酶USP14底物的鉴定及其相关功能的探究[D];中国科学院上海药物研究所;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026