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《华中农业大学》 2016年
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二维类石墨烯材料抗病毒机理研究

叶十一  
【摘要】:由细菌和病毒引起的传染病对人类及动物的健康造成了极大的危害,虽然有些传染病通过疫苗得到了控制,甚至根除,但大部分的传染病仍未得到很好的控制。不同血清型及毒株之间交叉保护率弱、新变异毒株不断出现等使得传染病的防控愈发艰难,因此,研究病毒致病机理及开发有效的抗病毒制剂对病毒性疾病的防控和治疗有着重要意义。本研究构建稳定表达PEDV ORF3的Vero细胞系,研究ORF3基因对细胞及PEDV病毒复制的影响,为揭示PEDV的致病机理提供理论依据。研究了二维片状纳米材料对PEDV及PRV的抗病毒作用及其可能的抗病毒机理,为新型抗病毒材料的研发提供基础。具体研究内容如下:1.构建稳定表达PEDV ORF3的Vero细胞系,分析ORF3对细胞周期、囊泡形成及病毒增殖的影响。通过慢病毒系统获得稳定表达PEDV ORF3的Vero细胞系,传代后仍能稳定表达ORF3。流式细胞术检测Vero及Vero-ORF3的细胞周期分布发现Vero-ORF3细胞中超过40%的细胞聚集在S期,而在Vero细胞为28.03%,表明表达ORF3可延长Vero细胞的S期。另一方面,超薄切片可以看出Vero-ORF3中囊泡的数量明显多于Vero细胞及转染截短ORF3的Vero细胞,并且还在Vero-ORF3细胞中观察到双层膜结构的囊泡,表明ORF3可促进细胞囊泡的形成,与病毒的复制密切相关。经TCID50及qPCR结果验证,两种PEDV弱毒株(AH-M及CV777疫苗株)在Vero-ORF3细胞上的量均高于Vero细胞,但强毒株(YN株)却没有表现出差异,Western blot结果也表明Vero-ORF3上PEDV N蛋白表达量明显高于Vero细胞。这些结果表明ORF3可促进PEDV弱毒株的增殖,但对强毒株没有影响。2.氧化石墨烯抗病毒研究通过噬斑形成试验、间接免疫荧光及Western blot验证,我们发现氧化石墨烯纳米材料对伪狂犬病毒(DNA病毒)及猪流行性腹泻病毒(RNA病毒)均有具有很好的抗病毒效果,并且这种抑制效果具有时间及剂量依赖效应。在病毒感染不同阶段加入GO发现其对病毒的抑制作用仅发生在病毒进入细胞之前,表明GO抗病毒作用发生在细胞外,很可能为直接接触发生的物理作用。为揭示了氧化石墨烯抗病毒机制,我们比较了GO及rGO抗病毒效果,发现它们效果一致,表明GO抗病毒作用不依赖于含氧基团。通过比较石墨、氧化石墨及GO发现多层片状的的氧化石墨抗病毒效果明显弱于单层结构的GO及rGO,而无定形的石墨不表现抗病毒作用,表明GO独特的单层结构对其抗病毒作用至关重要。随后,我们利用阳离子聚合物PDDA与GO复合,带正电荷的GO-PDDA复合物的抗病毒作用消失,而将GO与非离子聚合物PVP结合后仍带负电,保持其抗病毒活性,表明负电荷也在GO的抗病毒作用中有重要作用,因此我们推测GO可通过静电作用与病毒直接接触,利用其锋利的边缘结构破坏病毒结构,从而发挥抗病毒作用。3.类石墨烯材料MoS_2及WS_2抗病毒研究我们还发现其它二维片状纳米材料二硫化钼、二硫化钨也具有良好的抗病毒效果,但与氧化石墨烯相比,其抑制作用降低,并且其细胞毒性也比GO低。随后对MoS_2及GO抗病毒效果进行动物实验,评价其体内抑制病毒的能力。以猪伪狂犬病毒HNX株(103TCID50)感染Balb/c小鼠,攻毒组小鼠全部死亡,而GO及MoS_2与PRV孵育后攻毒组均有60%小鼠存活;攻毒后静脉注射GO组小鼠全部死亡,而注射MoS_2组小鼠还有40%小鼠存活。GO+PRV、MoS_2+PRV及MoS_2治疗组可对小鼠提供保护,并且小鼠发病时间延后1 d,且小鼠脑组织内病毒含量减少,表明MoS_2及GO可抑制PRV在体内的增殖,并且在感染后注射MoS_2仍具有保护效果。4.MoS_2及GO小鼠毒性研究为验证MoS_2及GO的毒性,采取动物攻毒实验中20倍治疗剂量(GO为2 mg/kg体重,MoS_2为10 mg/kg体重)静脉注射小鼠,分别于2、14、60 d取小鼠进行组织切片及血液学检测,结果表明小鼠主要实质器官(肺、肝、肾、脑)与对照组并无差异,未表现实质损伤,血常规及血清生化检测肝、肾功能各项指标也未见异常,证明我们实验浓度下MoS_2及GO对小鼠并无明显毒性作用。本研究发现PEDV ORF3可使细胞S期延长,并促进细胞囊泡的形成,从而促进PEDV弱毒的增殖,为PEDV致病机理研究提供基础。我们也首次发现了二维类石墨烯材料具有优越的抗病毒效果,并揭示了其中可能的机制,为新型抗病毒材料的研发提供依据。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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