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Characterization of Flavonoid Specific Malonyltransferases from Soybean (Glycine Max Merr.)

MUHAMMAD ZULFIQAR AHMAD  
【摘要】:异黄酮和黄酮类化合物广泛存在豆科植物的许多组织和器官中,共同参与各种生物学过程。异黄酮在植物防御生物和非生物胁迫中具有至关重要的作用。大豆中的异黄酮化合物主要有大豆素(daidzein)、染料木素(genistein)、染料木素(glycitein)的单体化合物以及它们的葡萄糖基、丙二酰基衍生物。异黄酮的苯丙烷生物合成途径已经有了广泛和深入的研究,前期的合成步骤及相关合成酶已经非常清楚,但后期参与异黄酮修饰的催化过程和相关合成酶还不清楚,以及其调控机制尚未完全了解。大豆中异黄酮糖甙丰富的丙二酰基衍生物具有许多未知的生理功能,目前已知丙二酰化(malonylation-)可能具有稳定黄酮或异黄酮类化合物的作用,增强它们的溶解度,促进它们的运输或在植物中的储存。丙二酰基转移酶(malonyltransferase)负责在异黄酮7-0-β-D-葡萄糖苷(GmIF7GT)加上一个malony基团成为异黄酮7-0-(6“-malonyl-β-D-葡萄糖甙(GmIF7MaT),但参与这一过程的合成调控基因尚不清楚,同样其代谢产物的生理功能也不清楚。本文中我们研究了两个新的BAHD家族异黄酮葡萄糖苷丙二酰转移酶GmIMaT1和GmIMaT3。本研究的主要研究结果如下:根据基因在大豆不同组织的表达水平,我们最终选择克隆了蒺藜苜蓿MtMaT1的4个大豆同源基因GmIMaT1、GmIMaT2、GmIMaT3和GmIMaT4。生化研究表明,4个基因只有GmIMaT 1和GmIMaT3两个基因可以利用丙二酰辅酶A (malony1-CoA)和几个异黄酮7-O-葡萄糖甙作为基质。用农杆菌侵染分别获得GmIMaT1和GmIMaT3的超表达和RNAi大豆转基因发根。定量PCR检测转基因发根,结果显示与GUS对照发根相比过表达和RNAi分别提高和降低了相应基因的转录水平。超表达GmIMaTs能提高malonyldaidzin和丙二酰染料木甙(malonylgenistin)的含量;另外超表达GmIMaT 1还能够提高黄豆苷和黄豆黄素的含量,超表达GmIMaT3还能够提高黄素和染料木素的含量。GmIMaT1-RNAi和GmIMaT3-RNAi转基因发根中丙二酰大豆甙(malonyldaidzin)和丙二酰染料木甙(malonylgenistin)的含量降低,但对其它异黄酮单体影响存在差异。基因定位分析表明,GmIMaT1主要定位在内质网(ER)而GmIMaT3主要定位在胞质(cytosol)。我们检测了在热激、冷害、干旱、铝胁迫等逆境胁迫以及脱落酸和茉莉酸甲酯处理对异黄酮变化的影响以及GmIMaT1和GmIMaT3的表达变化。在不同处理之间异黄酮的积累存在差异,而GmIMaT1和GmIMaT3的表达与丙二酰基异黄酮(malonylisoflavone)的积累相关。因此我们认为GmIMaT 1和GmIMaT3具有不同组织表达模式,并且能感受不同的逆境压力参与异黄酮7-O-葡萄糖甙的修饰。GmIMaTs同样能够影响大豆的结瘤。通过转基因发根产生GmIMaTs-OE和GmIMaTs-RNAi的大豆转基因嵌合植株。结果显示,GmIMaTs-OE能显著增加结瘤数目,而GmIMaTs-RNAi的结瘤数量与GUS对照相比明显降低。定量PCR检测GmIMaT1和GmIMaT3以及结瘤信号基因的表达水平,在过表达发根中的表达上调,在RNAi发根中被检测基因的表达水平下调。过表达GmIMaT1和GmIMaT3发根结瘤数目显著提高同时丙二酰基异黄酮的含量也显著提高;而在GmIMaT1-RNAi和GmIMaT3-RNAi发根的结瘤数目显著减少,同时丙二酰基异黄酮的含量也显著降低。用根瘤菌USDA110侵染大豆根后定量检测GmIMaTs的表达水平,结果显示GmIMaT1的表达量在侵染6-12h后显著提高;而GmIMaT3的表达水平在侵染6-12h后略有增加,然后在48 h表达水平恢复到初始表达水平。


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