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《华中农业大学》 2017年
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鸭疫里氏杆菌sprA基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究

胡迪  
【摘要】:鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡和其它禽类感染全身性浆膜炎的病原体,由于它血清型众多、各血清型之间的交叉保护率低以及对抗菌药物的耐药性,使得鸭疫里氏杆菌病的防控难度日益增大,该病已成为严重危害全球水禽业的细菌性疾病之一。蛋白分泌系统和病原菌的致病性是密不可分的,致病菌通过蛋白分泌系统分泌胞外酶、蛋白酶、毒力因子等破坏宿主细胞,引起病理损伤和组织坏死。Por分泌系统(Por protein secretion system,PorSS),又被称为IX型分泌系统(T9SS),目前发现仅分布于拟杆菌门成员中,介导拟杆菌门细菌的运动性、蛋白分泌及致病机制。本实验室已完成鸭疫里氏杆菌血清1型云梦分离株(RA-YM)的基因组测序,通过生物信息学分析发现该基因组存在完整的编码PorSS的基因。因此,本研究针对RA-YM的PorSS系统SprA基因进行缺失,并开展对缺失株ΔsprA其生物学特性和致病性的研究;同时提取野生株RA-YM和缺失株ΔsprA的外膜蛋白,利用串联质谱标签(Tandem Mass Tags,TMT)相对定量蛋白组学技术分析RA-YM和ΔsprA差异外膜蛋白,发掘通过PorSS分泌的外膜蛋白,明确PorSS分泌到外膜的蛋白与鸭疫里氏杆菌致病性的关系。本研究取得的结果如下:1.鸭疫里氏杆菌sprA基因缺失突变株的构建与生物学特性研究扩增出sprA基因的左、右同源臂(L、R)和壮观霉素抗性基因(S),利用overlap PCR的方法将L、S、R融合,构建抗性基因表达盒LSR,将LSR连至p RE112,构建重组自杀性质粒pRE-LSR。将重组自杀性质粒转化至E.coli X7213中,挑取阳性克隆,以含有pRE-LSR的E.coli X7213为供体菌,RA-YM为受体菌,进行结合转移试验,在含壮观霉素的平板上挑选阳性菌落并利用双重PCR鉴定缺失株。得到缺失株后在含壮观霉素的TSA平板上盲传5代评价其遗传稳定性。同时研究了ΔsprA与RA-YM的生长特性和生化特性,结果显示在对数早期ΔsprA在TSB生长速度快于野生株RA-YM(P0.05),后期生长速度没有显著性差异;ΔsprA与野生株RA-YM的基本生化特性基本一致,都不发酵糖类,可以利用尿素,野生株RA-YM可以液化明胶,ΔsprA不能液化明胶。在12.5%鸭血清中缺失株ΔsprA的存活率显著低于同等条件下野生株RA-YM的存活率(P0.01)。2.RA-YM株与ΔsprA对雏鸭致病性的研究对13日龄的樱桃谷肉鸭进行感染试验,感染途径腿部肌肉注射,结果显示野生株RA-YM的LD50为7.21×104 CFU,缺失突变株ΔsprA的LD50为3.61×107 CFU,与RA-YM相比,ΔsprA的毒力下降了约501倍。比较野生株和缺失突变株的载菌量,结果表明在感染24h后,ΔsprA在血液和脾脏组织中的载菌量低于RA-YM(P0.05);在感染48h后,ΔsprA在血液、肝脏、脾脏和脑组织中的载菌量低于RA-YM(P0.05)。组织剖检和病理切片观察结果也表明,心脏、肝脏、脾脏和脑的病变程度,缺失突变株ΔsprA较野生株RA-YM轻微。3.RA-YM株与ΔsprA的明胶酶谱试验及LC-MS/MS测序分析生化试验结果显示野生株RA-YM能液化明胶,缺失突变株ΔsprA不能液化明胶;明胶酶谱试验结果显示,野生株RA-YM和缺失株ΔsprA存在三条差异性条带,经蛋白质测序及生物信息学分析,获得7个通过PorSS分泌的蛋白,其中丝氨酸S8家族蛋白酶RAYM_04099、RAYM_01812和带有金属磷酸酶保守结构域RAYM_03382可能是导致明胶液化、毒力下降的原因。4.鸭疫病里氏杆菌外膜蛋白串联质谱标签相对定量蛋白组学(TMT)分析使用Na2CO3法提取了野生株RA-YM和缺失突变株ΔsprA的外膜蛋白,利用TMT分析外膜蛋白差异。蛋白质组学检测结果显示,一共鉴定到1387个蛋白,213个外膜蛋白,差异表达外膜蛋白共有65个,其中上调蛋白43个,下调蛋白22个。将差异表达的外膜蛋白进行GO聚类分析,发现这些蛋白参与信号转导、蛋白质的酶解、细菌的氧化平衡、DNA的代谢过程等生物过程,与蛋白结合活性、受体活性、DNA结合活性、转运活性等分子功能相关;对鉴定到蛋白质的保守结构域进行分析,共找到12个通过PorSS分泌的蛋白,包括4个上调蛋白,1个下调蛋白。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

【参考文献】
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