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《华中农业大学》 2017年
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籼粳稻杂种不育系统S5的蛋白互作及转录组研究

朱艳芬  
【摘要】:水稻既是重要的粮食作物,也是单子叶植物基因组研究的模式植物,是生殖隔离研究的模式系统。亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻两个亚种,其杂种通常高度不育,阻碍了对亚种间杂种强大杂种优势的利用。S5是控制籼粳杂种胚囊育性的主要位点,包括ORF3,ORF4和ORF5三个连锁基因。典型籼稻的基因型为ORF3+/ORF4-/ORF5+,典型粳稻的基因型为ORF3-/ORF4+/ORF5-。细胞壁蛋白ORF5+与跨膜蛋白ORF4+共同诱导内质网胁迫进而引起细胞程序性死亡从而导致雌配子败育,内质网蛋白ORF3+则能够阻止或者缓解内质网胁迫阻止雌配子被杀死从而恢复正常育性。本研究从分子细胞学和转录组角度对S5作用机理进行了研究。我们构建了粳稻Balilla穗组织的酵母双杂交文库。利用ORF3,ORF4和ORF5的各种全长以及截短的蛋白作为诱饵筛选文库,并利用ORF5-得到了两个候选基因,但是经过进一步验证之后发现是假阳性。根据对S5作用模式的设想,我们研究ORF4+与膜受体蛋白如S1L4、LYP4和LYP6的互作关系,但是发现也不互作。我们构建了ORF5+-GFP与ORF4+-GFP转烟草BY-2悬浮细胞的稳定细胞系,对ORF5+和ORF4+的蛋白性质进行了初步研究。为了研究位于细胞壁的ORF5+是否通过破坏细胞壁释放寡糖信号分子,我们用三种寡糖对ORF4+-GFP的细胞系进行处理,发现这些寡糖不能诱导细胞的死亡。另外我们也对ORF4+是否为ORF5+的底物进行了初步探究,将ORF5+与N端或者C端带荧光蛋白的ORF4+共同转入烟草叶片,观察ORF4+的定位变化,但是并未观测到有改变。在BY-2细胞系和烟草瞬时转化过程中,我们发现融合了荧光蛋白的ORF5+并不定位在细胞壁上,推测融合的标签可能会影响ORF5+的功能。但是,我们发现ORF5+或者ORF5-融合GFP标签的拟南芥稳定转化植株能够降低叶片中PR基因表达量。ORF5+编码天冬氨酸蛋白酶,转基因植株BalillaORF5+不育。为了探究ORF5+酶活功能是否为必需,我们将其两个酶活位点的天冬氨酸D132和D337分别和同时诱变为天冬氨酰并转入Balilla,发现不管是分别诱变还是同时诱变类型都正常可育。因此,我们认为ORF5+的酶活是其发挥功能所必需的。ORF4+编码一个N端在细胞外,C端在细胞内的单次跨膜蛋白。ORF4+-GFP与内吞marker部分重合,暗示其可能参与内吞。我们对ORF4+预测的内吞位点进行诱变,发现这些位点与ORF4+的内吞现象无关。ORF4+超表达植株BalillaORF4+OX株高变矮,分蘖数减少,其叶片会产生假病斑并积累胼胝质,植株对白叶枯病菌PXO341的抗性增强,Balilla ORF4-OX则不会出现这些表型,这说明ORF4+和ORF4-的功能差异很大。另外,我们利用基因敲除技术CRISPR在Balilla中成功敲除了ORF4+,获得了一个S5位点为ORF3-/ORF4-/ORF5-的植株。通过比较Balilla,败育的BalillaORF5+和育性恢复的BalillaORF3+ORF5+胚囊发育过程,我们将胚囊败育过程划分为三个时期(MMC,MEI和AME)并研究了这些时期的转录组数据。通过比较BalillaORF5+和Balilla,发现ORF5+在MMC时期引起大量细胞壁重构基因如EXP,XTH,GH9,PAE,PME,PGase和AGP的上调表达,这些基因可能导致细胞壁完整性的破坏,并诱导了下游的生物和非生物胁迫反应以及内质网胁迫。MEI时期,持续的胁迫反应激活了由TIP2,TDR,OsAP25和OsAP37介导PCD过程。此外胚囊细胞通过上调表达OsSWN1,OsMYB46,OsCesA4,OsCesA7和OsCesA9等控制次生细胞壁合成的基因大量合成纤维素并通过调控胼胝质代谢大量积累胼胝质以稳固细胞壁。AME时期,败育的胚囊中积累了大量的纤维素和胼胝质。通过比较BalillaORF3+ORF5+和Balilla,我们发现MMC时期ORF5+在BalillaORF3+ORF5+依然能够引起部分细胞壁重构基因的上调表达进而引起胁迫反应。由于ORF3+的存在,这些反应没有BalillaORF5+强烈,并且在MEI时期被抑制,胚囊正常发育。ORF3+是一个分子伴侣蛋白,我们推测ORF3+可能通过修饰ORF4+的互作蛋白或者下游的信号分子抑制胁迫信号。通过BalillaORF3+ORF5+与BalillaORF5+的对比发现ORF3+使BalillaORF3+ORF5+中与抗病抗逆相关的基因,如OsMTs,OsLEAs和OsPR10a等的表达量都大幅度上调。本研究对S5位点的三个基因功能做了进一步的研究,揭示了ORF5+的酶活对其功能的重要性,ORF4+与抗病的相关性。结合Balilla,BalillaORF5+和BalillaORF3+ORF5+的转录组分析结果,认为ORF5+可能破坏细胞壁的完整性,被细胞膜上的ORF4+感知,向细胞内传递信号引起生物和非生物胁迫以及内质网胁迫和PCD。ORF3+存在时,内质网胁迫被抑制且抗逆能力增强从而抑制了ORF5+引起的胁迫反应,故胚囊正常发育。本研究有助于我们进一步理解S5的作用机理,为更好在生产上利用S5提供理论依据。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S511

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