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《华中农业大学》 2016年
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小反刍兽疫新型快速实用检测方法的建立及评估

程思  
【摘要】:小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性接触性和高度致死性的烈性传染病。其特征是发热急、高热稽留、口炎、腹泻和肺炎。对绵羊、山羊等小反刍动物危害严重,山羊发病严重,易感羊群的发病率和死亡率可达100%,野生动物也可感染。是世界动物卫生组织(OIE)列出的通报(notifiable)疫病,也是我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中的一类动物疫病。此病1942年首先在非洲的科特迪瓦发生,目前在全球70多个国家流行,包括中东、非洲和亚洲大部,是一种跨境动物传染病,对发展中国家畜牧生产造成了严重的影响。鉴于PPR目前在全球的传播形势,2015年OIE与世界粮农组织(FAO)正式启动了PPRV根除计划(GCES),计划于2030年前全球根除PPR。我国于2007年7月首次在西藏阿里地区暴发PPR疫情,自2013年11月起小反刍兽疫在我国多个省市地区连续发生,疫情传播快、跨度大、风险高,为此,农业部于2015年12月印发了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016—2020年)》,对国内该病的防控工作提出了新的要求。基于2010年人类实现牛瘟全球根除的成功经验,敏感快速的诊断方法对于PPR的防控及根除至关重要。传统诊断方法如病毒分离、血清中和试验、琼脂免疫扩散试验等,或费时费力,或特异性和敏感性不高;新型诊断方法如RT-PCR、荧光定量RT-PCR等试验,虽然较为快速敏感,但需要特殊设备且只能由专业技术人员在实验室中完成,不能满足基层实验室或临床现场快速检测的需求。为实现2018年,全国所有免疫省份达到免疫无小反刍兽疫区的要求,实验室或基层现场一方面需要对大批量免疫动物进行快速特异性诊断、及时评价免疫效果,另一方面由于国内PPRV弱毒活疫苗(Nigeria75/1株)的使用,实验室检测中难以区分疫苗株和野毒株,不利于PPR疫情的流行病学调查及最后阶段的防控根除。为此,本研究针对上述实际工作需求,探索建立了一套适用于基层根除防控的实用快速检测方法,包括第一步在临床现场对PPRV免疫后效果进行快速评估(Post vaccination evaluaton,PVE),其次在实验室对感染情况进一步进行血清学筛查(流行病学调查),如果发现PPRV感染,则对PPRV疫苗株及野毒株进行实验室鉴别诊断(Differentiation of infected and vaccinated animals,DIVA),通过上述检测,掌握免疫情况及感染状况,为下一步的防控措施提供科学依据,是小反刍兽疫最终实现净化根除检测技术的应用型研究。具体研究内容包括:使用水溶性羧基功能化量子点(QDs)作为荧光标记,通过酰胺键与链球菌G蛋白(SPG)共轭,经QDs标记的SPG与PPRV抗体(IgG)结合,再与检测线上的昆虫杆状病毒表达的AcNPV-PPRV-N重组蛋白发生免疫反应,在365nm的紫外线激发光下可见高亮的荧光带,建立了检测PPRV血清抗体的新型超敏荧光量子点免疫层析快速检测技术(QDs-LFIAS)。该方法抗体浓度与荧光强度直接关联,使用成本低廉、维护保养简单的仪器在15min内读取结果。评估其分析敏感性(Analytical Sensitivity,ASe)明显优于竞争ELISA检测方法(Competitive ELISA,C-ELISA)(OIE推荐的血清学检测金标准)及胶体金免疫层析技术(Immunochromatographic Strip ICS)。检测蓝舌病、犬瘟热、羊痘及口蹄疫病毒阴性,分析特异性(Analytical Specificity,ASp)100%。与C-ELISA检测方法同时检测临床样本,评估其诊断特异性(Diagnostic Specificity,DSp)及敏感性(Diagnostic Sensitivity,DSe)分别为99.47%和97.67%,一致性良好,适用于临床现场对小反刍兽疫的免疫效果进行快速评价(PVE)。2.小反刍兽疫病毒双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)快速检测方法的建立及评估利用免疫杂交瘤细胞技术,筛选获得稳定分泌PPRV单克隆抗体(Monoclonial Antibody,MAb)的杂交瘤细胞株(5B11),利用该细胞株产生的针对PPRV N抗原的特异性MAb以及PPRV疫苗株全病毒免疫蛋鸡获取的PPRV特异性鸡卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin,IgY),建立了检测血清中PPRV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)新型快速实用检测方法。评估其分析特异性(ASp)结果显示,该方法检测PPRV阳性样品结果为阳性,检测蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒为阴性,特异性100%。与RT-PCR方法同时检测临床样品,评估其DSp和DSe分别为99.2%和93.9%,两种方法检测结果的符合率为98.1%。重复性检测结果批内变异系数在2.14%~6.18%之间,批间变异系数在4.82%~8.37%之间,表明建立的双抗体夹心ELISA检测方法重复性良好,适用于对小反刍兽疫免疫带毒或野毒感染情况进行实验室快速血清学筛查及流行病学调查。3.区分小反刍兽疫疫苗株与野毒株的实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法的建立及评估对我国西藏地区使用的PPRV弱毒活疫苗毒株(Nigeria75/1)进行全基因组序列测定,分析比较已报道的PPR西藏野毒株的基因组核酸序列,选择两者差异较大的特异区段设计了2套实时荧光RT-PCR的引物和TaqMan探针分别用于检测PPRV疫苗株和野毒株,筛选最佳的引物、探针浓度,优化反应体系和条件,针对我国PPRV防控实际需要,建立了区分小反刍兽疫活疫苗株与野毒株(differentiation of infected1.小反刍兽疫血清抗体超敏荧光量子点免疫层析快速检测技术(QDs-LFIAS)的建立及评估and vaccinated animals,DIVA)的新型实时荧光定量RT-PCR快速鉴别诊断方法。特异性分析结果显示,检测疫苗株的荧光RT-PCR只能检测到PPR疫苗毒株,检测对照病毒及PPR野毒株均为阴性;检测野毒株的荧光RT-PCR只能检测到PPR野毒株,检测对照病毒及PPR疫苗株均为阴性,说明建立的上述鉴别诊断方法特异性强。灵敏度(Limit of detection,LOD)分析表明,检测疫苗株的荧光RT-PCR最低检出核酸数量级为1.38pg/μL,检测野毒株的荧光RT-PCR最低检出核酸数量级为0.16pg/μL,适用于我国目前防控PPRV对PPRV感染动物及免疫动物进行实验室鉴别诊断(DIVA)及流行病学调查,是我国在2020年前最终实现PPRV根除的必要技术手段。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S855.3

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