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《华中农业大学》 2018年
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蓖麻葡萄孢Amphobotrys ricini多样性研究

张蕊  
【摘要】:灰霉病是由葡萄孢属真菌(Botrytis)及葡萄孢属类似真菌(Botrytis-like)引起的一种世界性分布的真菌病害,造成严重的经济损失。Amphobotrys是一种葡萄孢属类似真菌,该属真菌只有一个种,即Amphobotrys ricini(Buchw.)Hennebert,主要侵染大戟科植物,包括蓖麻、铁苋菜、一品红、虎刺梅和佛肚树等。但是从Amphobotrys属研究历史及现状可以看出,针对该类病菌病原学研究相对薄弱。因此本研究对Amphobotrys属菌株分类属性鉴定、遗传多样性、交配型检测及交配型基因结构和真菌病毒多样性开展了研究,取得的主要研究结果如下:(1)明确了Amphobotrys在分类上属于核盘菌科以及200个Amphobotrys菌株为同一个种,即A.ricini。完成了菌株WHA-1全基因组测序,基因组大小为34.99 Mbp,利用基因组中的1813个核心基因构建了含15种真菌的系统发育树,结果表明菌株WHA-1与其它7种核盘菌科真菌聚为一支。可见菌株WHA-1在分类上属于核盘菌科。200个Amphobotrys菌株菌落形态、菌丝生长速度、分生孢子和分生孢子梗形态与Amphobotrys ricini(Buchw.)Hennebert一致。对200个菌株的ITS、G_3PDH、HSP_(60)以及RPB_2这4个基因进行测序,通过同源比对及构建系统进化树,结果表明所有的菌株聚为一支。形态学与分子鉴定结果都表明200个菌株属于同一个种,即A.ricini(Buchw.)Hennebert。(2)通过对82个A.ricini菌株进行RAPD分析,表明A.ricini菌株具有丰富的遗传多样性。从50条RAPD引物中筛选出多态性强、重复性好的8条引物,对82个A.ricini菌株进行了遗传多样性分析。结果显示:8条引物共扩增出63条DNA条带,其中49条DNA条带为多态性条带,多态性比率为77.8%,多态性信息含量(PIC)值变化范围在0.47~0.84之间,平均值为0.72。观测等位基因数(Na)为2.0000、有效等位基因数(Ne)为1.3577、Nei's基因多样性指数(H)为0.2275和Shannon信息指数(I)为0.3631。聚类分析表明,遗传相似系数变化范围在0.4082~1.0000之间,在遗传相似系数0.74处,可将82个供试菌株划分为6个RAPD群。RAPD类群与菌株地理来源及寄主植物具有一定的相关性。(3)明确了A.ricini群体交配型分布规律及交配型基因结构。检测了200个A.ricini菌株的交配型,其中170个菌株为MAT 1-1型,占85%;21个为MAT 1-2型,占10.5%;9个为MAT 1-1/MAT 1-2型,占4.5%,在供试菌株中,MAT 1-1型是优势交配型。通过对A.ricini的MAT 1-1和MAT 1-2交配型基因结构进行分析,发现A.ricini整个MAT 1-1基因座长度为8226 bp,包含四个基因位点:APN2(DNA lyase)、SLA2(cytoskeleton assembly control)、MAT 1-1-1、MAT 1-1-5,其中MAT 1-1-1编码保守的Alpha domain;整个MAT 1-2基因座长度为11992 bp,包含五个基因位点:APN2(DNA lyase)、SLA2(cytoskeleton assembly control)、MAT 1-2-1、MAT 1-2-4以及部分MAT 1-1-1基因序列(truncated MAT 1-1-1),其中MAT 1-2-1编码保守的高迁移率蛋白盒子结构域(HMG domain),可以编码197个氨基酸。根据这一结果推测A.ricini有性繁殖可能为异宗配合。(4)分析了200个A.ricini菌株中真菌病毒的多样性规律。采用高通量测序技术对200个菌株的总RNA进行了测序,将拼接序列通过NCBI的Blastx进行比对,共得到948条病毒序列,平均长度为1247 bp。依据核酸类型,将这些病毒序列分为正单链RNA病毒、负单链RNA病毒、双链RNA病毒,其中+ssRNA病毒占88.1%,-ssRNA病毒占0.9%,dsRNA病毒占11%。通过RdRp系统发育分析发现A.ricini群体中病毒种类共12个科和18个属及几个新的真菌病毒新类群,表明A.ricini群体中病毒类群比较丰富。设计两条病毒特异引物对40个组的A.ricini菌株(5个菌株为一组)进行RT-PCR验证,结果表明87%的组都可以扩增出病毒片段,说明这两条病毒序列在A.ricini群体中分布比较广泛。上述研究结果有助于认识A.ricini群体结构和生物学特性。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S432.44

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【参考文献】
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