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《华中农业大学》 2018年
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猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型毒素—抗毒素系统的鉴定与功能研究

赵席功  
【摘要】:胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种能够引起临床上以急性出血和坏死性、慢性纤维素性胸膜肺炎为主要特征的高度接触传染性疾病猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumoniae,PCP)的病原菌,一旦发病,将给国内外养猪业带来很大的经济损失。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是一种在细菌和古生菌中广泛分布的小型基因组件。大多TA模型在许多细菌中已经被研究,并被证实在细菌生理机能和毒力方面起着重要作用。然而,在放线菌属中还没有被研究。因此,本研究主要研究猪胸膜肺炎放线杆菌中TA系统的分布存在情况,深化我们对APP生物学特性的认识;对APP中TA系统进行预测鉴定并对鉴定为TA系统的作进一步功能研究,希望可以筛选出与毒力相关的TA系统,为临床上弱毒疫苗及药物靶标的研究提供参考。主要研究内容如下:1、APP中Ⅱ型TA系统的鉴定在APP中,通过Ⅱ型TA系统预测软件RASTA-Bacteria和TADB2.0预测胸膜肺炎放线杆菌JL03菌株中TA系统,并选择两软件预测相同的7对作进一步的研究。通过RT-PCR实验验证TA基因共转录;超表达毒素使细菌生长受到抑制,但这种抑制可被其同源抗毒素中和;pull-down实验表明毒素与其同源抗毒素在体内发生相互作用;启动子活性实验表明抗毒素能够促进或者抑制自动调节TA操纵子的转录活性;此外,APJL_0660/0659 TA系统在被检测的部分APP血清型中存在,而其它3对TA系统在所检血清型中都存在。最终,我们在APP中确定了4对TA系统,为进一步的功能研究奠定基础。2、APP中4对TA系统的功能研究首先,通过自杀性质粒pEMOC2构建重组质粒pEΔTA,将测序正确的pEΔTA转化到β2155感受态中,将pEΔTA/β2155与亲本菌株APP5进行结合转移,挑出单交换菌株,进一步通过单交换传代挑取到基因缺失株ΔTA。其次,通过E.coli-APP穿梭质粒pJFF224-XN构建重组质粒pJFTA,将重组质粒电转化到ΔTA感受态中,挑菌鉴定氯霉素抗性菌株即可得到互补菌株CΔTA。最后,研究缺失株及互补菌株的生长特性、遗传稳定性和对小鼠的毒力。结果显示:CΔTA3和ΔTA3生长特性与APP5略有差异,而其它3对TA系统生长特性与亲本菌没有明显差异;4对TA系统对APP5的毒力没有影响。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.61

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【相似文献】
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