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《华中农业大学》 2017年
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口服KISS1基因疫苗构建及其对绵羊生殖轴的影响

BIRHANU TESEMA  
【摘要】:手术去势能够显著提高公畜的脂肪沉积并使其变得温顺。因此几个世纪以来广泛应用于畜牧生产。虽然手术去势能够彻底去除公畜的生殖能力,但是普遍有着技术要求高和术后容易感染等缺点,即使进行麻醉动物应激反应依然较大,使得短期内公畜的生长性能下降。后来,科学家开始寻找替代手术去势的方法,从而开发出免疫去势。基于GnRH基因疫苗能够诱导表达GnRH抗体,通过降低体内GnRH水平而降低血清睾酮水平,抑制性行为。KISS-1基因产物kisspeptin通过与G蛋白偶联受体(GPR-54)之间的互作,激活下丘脑中GnRH神经元,控制GnRH的合成与分泌,进而促进促性腺激素(LH和FSH)的分泌:在调节动物发情期和生殖活动上发挥着至关重要的作用。Kisspeptin和GPR-54是控制青春期的重要上游调节因子。促性腺激素释放激素(GnRH)是促性腺激素的中枢调节因子,能够通过刺激GnRH释放促进性腺的发育和功能。在哺乳动物中,干扰该信号通路能够引起低促性腺激素性性腺机能减退。本研究分析口服kisspeptin重组基因疫苗对羔羊生殖生理和行为的作用,评估活性kisspeptinDNA疫苗口服免疫对激素受体mRNA和蛋白表达的有效性。主要研究结果如下:(1)构建C500/pKS-asd真核表达质粒。将本课题组构建的PVAX-KISS-1-S-asd质粒电转化至减毒猪霍乱沙门氏菌C500中,经测序和酶切鉴定挑选阳性克隆,命名为C500/pKS-asd重组菌,在无菌培养基中连续接种50代,提取质粒以及细菌基因组DNA,用双酶切和沙门氏菌属中保守InvA基因序列的PCR扩增鉴定重组真核表达质粒和重组菌株的传代稳定性。将菌株C500/pKS-asd和C500/pVAX-asd分别用50μL/mg二氨基庚二酸(DAP)接种到LB肉汤,并在650 nm(OD 650)处以0.5的光密度下过夜。4℃、12,000 rpm离心10分钟收集细菌。在接种到羔羊之前,通过将接种物稀释到LB琼脂上来证实微生物的细菌细胞数,将细菌细胞调节至5×1010 CFU/ml剂量。离心后将细菌细胞重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行疫苗接种。(2)Kisspeptin基因疫苗口服免疫的去势效果将10只56日龄的羔羊随机分为实验组和对照组,分别接种实验重组疫苗C500/pKS-asd或C500/pVAX-asd。接种方式为口服给药,并且在初次免疫后的第28天和第56天重复相同的处理。在初免后的第0天,第14天,第28天,第42天,第56天,第70天和第84天测定阴囊周长并采血。于接种的第98天评估性行为,测量阴囊周长并收集血液样本。实验组羊羔的阴囊周长(19.82±3.18cm)显著低于免疫后第42-98天对照组(22.16±4.79cm)(P0.05),睾丸重量显著低于对照组(91.83±1.42 g VS 118.10±7.29g,P0.011),睾丸长度也显著低于对照组(6.64±0.11cmVS7.40±0.29,P0.05)。与对照组动物相比,实验组公羊曲细精管管腔内的精原细胞和精子产生量明显少于对照组,并且性行为显著降低(P0.01)。这些数据表明,kisspeptin疫苗的口服免疫能够抑制羔羊的性腺功能和性行为。(3)Kisspeptin基因疫苗口服免疫后的KISS-1抗体和血清睾酮水平。通过间接ELISA测量血清中抗kisspeptin-54抗体和睾酮水平。在免疫后第42天至实验期(第98天)结束时,试验组羔羊中检测到kisspeptin-54抗体。结果表明,与对照组相比,试验组kisspeptin-54抗体水平显著升高(P0.05,P0.01),而血清睾酮水平显著降低(P0.05)。这些结果表明,口服Kisspeptin疫苗可以诱导抗体并降低睾酮浓度水平,实现免疫去势。(4)Kisspeptin 口服免疫对下丘脑-垂体性腺轴中激素受体mRNA表达的影响取对照组和试验组的睾丸,下丘脑和垂体组织样。用TRIzol试剂从样品中提取总RNA,用定量实时聚合酶链反应(QPCR)来测定下丘脑内KISS1、GPR-54和促性腺激素释放激素(GnRH)mRNA的水平(P0.01,P0.05),垂体中黄体生成激素β(LHβ)、卵泡刺激素β(FSHβ)和促性腺激素释放激素受体(GnRHR)的mRNA水平睾丸内黄体生成激素受体(LHR)和促卵泡激素受体(FSHR)的mRNA水平。与对照组相比,实验组睾丸FSHR和LHR mRNA 水平显著降低(P0.01),下丘脑 kissipeptin、GPR54 和 GnRH mRNA水平明显低于对照组(P0.01,P0.05)。此外,去势免疫组LHβ,FSHβ,GnRHR mRNA表达明显降低(P0.05,P0.001)。这些数据表明,口服Kisspeptin基因疫苗可影响下丘脑-垂体性腺轴激素受体mRNA的表达水平。(5)口服Kisspeptin疫苗接种对活重的影响实验组动物体重与对照组动物体重无显着差异,说明口服kisspeptin基因免疫不影响动物生长。综上所述,kisspeptin基因重组口服疫苗能够抑制睾丸发育和精子发生,抑制羔羊体内激素受体mRNA和蛋白质的表达。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.4;S826

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