收藏本站
《华中农业大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

PEDV感染猪空肠组织的蛋白质组学分析及hnRNP A1影响PEDV复制的作用机制研究

李中华  
【摘要】:近年来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株引起的新型猪流行性腹泻在世界范围内暴发,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。然而,当前防控手段的匮乏无法应对PED带来的威胁。因此,研究PEDV的致病机理以及开发抗PEDV药物对PED的防控和治疗具有深远的意义。本研究基于iTRAQ技术,开展了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠组织的比较蛋白质组学分析,为揭示PEDV的致病机理和宿主的免疫应答提供参考。根据蛋白质组学的分析结果,研究了hnRNP A1和PEDV N蛋白的互作关系,为揭示PEDV的复制过程提供参考。研究了槲皮素的抗PEDV作用并阐明了其抗病毒机理,为PEDV的治疗和相关药物的开发提供了参考。主要研究内容如下:1.PEDV强毒株及其致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学分析本研究使用iTRAQ定量蛋白质技术结合液相二级质谱技术(LC-MS/MS),研究了PEDV强毒株及其传代致弱毒株感染仔猪空肠的蛋白质组学变化。在强毒株YN13株感染组和弱毒YN144感染组分别鉴定到269和301个差异表达蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要涉及应激反应,信号转导和免疫反应等过程。进一步分析发现,PEDV感染可以导致多种干扰素刺激基因的上调表达,表明PEDV感染会诱导宿主的先天性免疫过程。通过对比分析两感染组的蛋白,发现许多热激蛋白家族成员和一些转录翻译相关因子在两组中呈现不同的表达情况,提示这可能是造成两毒株致病性差异的因素。2.核不均一蛋白A1(hnRNP A1)参与PEDV的复制过程根据蛋白质组学结果,发现hnRNP A1在两病毒感染组表现为不同的表达情况,提示该蛋白的变化可能会造成病毒致病力的变化。首先研究了该蛋白在细胞中定位情况,通过共聚焦试验发现该蛋白和PEDV的N蛋白存在共定位,表明两者之间存在互作关系。使用免疫共沉淀技术,进一步确认了两者之间的互作关系。hnRNP A1和PEDV N蛋白的定位区主要位于核周,而核周是冠状病毒复制转录复合体存在的位置,提示hnRNP A1可能参与了该复合体的组成,进而参与了PEDV的复制过程。为了验证hnRNP A1是否参与了PEDV的复制过程,通过siRNA沉默hnRNP A1的表达,而后使用不同PEDV毒株感染。通过间接免疫荧光试验、荧光定量RT-PCR和Western blot试验发现hnRNP A1沉默后,PEDV的基因组、PEDV感染的细胞数量以及PEDV N蛋白的表达量都显著减少,说明hnRNP A1参与了PEDV的复制过程。结合蛋白质组学结果,推测hnRNP A1在YN144感染组的下调表达是造成两病毒毒力差异的原因之一。3.槲皮素抗PEDV研究通过间接免疫荧光和Western blot试验,发现槲皮素可以有效抑制PEDV的感染过程。首先研究了槲皮素对PEDV吸附和入侵过程的影响,发现其并不能抑制PEDV吸附和入侵Vero细胞,表明槲皮素抗PEDV的作用发生在病毒入侵宿主细胞之后。由于槲皮素是一种很好的HSPA1抑制剂,其可能通过抑制HSPA1发挥抗PEDV效果。为验证此设想,使用siRNA沉默HSPA1的表达,然后再感染PEDV,通过荧光定量RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot试验发现PEDV的感染过程并未受到影响。表明槲皮素的抗病毒效果并不依赖其HSPA1抑制剂的活性。通过Docking分析,发现槲皮素可以结合于PEDV 3C样蛋白酶的活性位点,表明其可能抑制PEDV的3C蛋白酶活性。表达纯化了PEDV的3C样蛋白酶,通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)验证了两者可以发生互作。为验证槲皮素是否可以抑制PEDV 3C样蛋白酶的活性,建立了一种荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法,通过该方法发现纯化的蛋白具有很好的酶活性,在酶反应体系中加入槲皮素,发现PEDV3C样蛋白酶的活性受到显著抑制,而且抑制效果呈剂量依赖性。因此,认为槲皮素可以通过抑制PEDV 3C样蛋白酶的活性而发挥抗PEDV效果。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.28

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;坚持不懈(泻)——汇聚PEDV防控实效经验[J];猪业科学;2018年03期
2 ;坚持不懈(泻)——汇聚PEDV防控实效经验[J];猪业科学;2018年05期
3 李鹏;吴梦郡;余魁;徐海旺;吴涛;易丹;王蕾;赵迪;侯永清;;幼龄仔猪PEDV感染肠道损伤模型的建立[J];中国畜牧兽医;2018年06期
4 丁尊俄;冯旭芳;张双翔;何贤海;胡兴义;张海;王开功;文明;程振涛;李晨;蒲翠敏;罗引幸;刘丽娟;周碧君;;贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查[J];基因组学与应用生物学;2018年06期
5 张丁华;王艳丰;;养猪场PEDV与其他腹泻相关病毒共感染状况及防控措施[J];黑龙江畜牧兽医;2018年14期
6 Wang Zhongze;Qin Cuili;Kong Ning;Zuo Yewen;Wang Meng;Zheng Hao;Tong Wu;Li Liwei;Yu Hai;Li Zhili;Shan Tongling;Tong Guangzhi;Li Xue;;Screening of Host Proteins Interacting with Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) N Protein by Yeast Two-hybrid System[J];Animal Husbandry and Feed Science;2018年04期
7 罗亚坤;梁琳;王静;刘存;刘琪;刘畅;蔺文成;崔尚金;;猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用[J];中国畜牧兽医;2017年02期
8 Qin Yibin;Lu Bingxia;Zhao Wu;He Ying;Li Yingying;Li Bin;Liang Jiaxing;Liang Baozhong;Su Qianlian;Jiang Dongfu;Zhou Yingning;;Development and Application of an RT-PCR Method for Differentiation of PEDV Variant Strains and Classical Strains[J];Animal Husbandry and Feed Science;2015年01期
9 李凯年;;证据表明在离被感染猪群较远空气中的PEDV也具有感染性[J];中国动物保健;2014年10期
10 李沛东;位玉玲;于少芳;郑佳佳;李龙;;猪体内PEDV病原含量与血清中PEDV抗体水平之间的关系初探[J];畜牧与兽医;2018年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 马志倩;田阳升;郭旭阳;王文静;周恩民;肖书奇;;猪流行性腹泻病毒PEDV SX-YL株的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年
2 Li Yongtao;Li Hongjie;Wang Xiaoxue;Wan Wenyan;Zhao Jun;;Identification of Non-structural Protein 7 of Porcine Epidemic Diarrhea Virus that inhibits Type I interferon response[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年
3 Liu Pinghuang;Li lin;;Isolate PEDV Specific Whole-porcine Neutralizing Antibody from Porcine Memory B cell through Single B cell PCR[A];第十一届全国免疫学学术大会分会场交流报告集[C];2016年
4 杨意;舒建洪;;PEDV全长感染性cDNA克隆的构建[A];中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议论文集[C];2016年
5 王隆柏;王晨燕;吴学敏;车勇良;陈如敬;周伦江;;福建省PEDV流行病学调查与S基因变异分析[A];福建省畜牧兽医学会2015年学术年会论文集[C];2015年
6 雷喜梅;陈静;杨盼盼;赵永祥;王晓梦;赵军;王川庆;;分泌抗PEDV变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年
7 董世娟;朱于敏;于瑞嵩;李震;;我国PEDV分子流行病学研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
8 胡兴义;张双翔;王开功;文明;周碧君;程振涛;张海;;猪流行性腹泻病毒疫苗免疫后乳汁中PEDV IgA消长动态研究[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年
9 陈苏;周晗;王丽;乔薪瑗;徐义刚;唐丽杰;李一经;;表达PEDV保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体的构建及其免疫原性分析[A];中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集[C];2016年
10 高玉;葛旭影;曹丽艳;李训良;任玉东;任晓峰;李广兴;;猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽筛选及其抗病毒作用[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会论文集[C];2015年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 上海巴斯德研究所;中科院揭示猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白的功能[N];中国畜牧兽医报;2012年
2 北京海正兴潮生物技术有限公司 周海云;猪流行性腹泻的综合防控措施[N];中国畜牧兽医报;2014年
3 记者 刘辛味;源头又是蝙蝠[N];北京科技报;2018年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李中华;PEDV感染猪空肠组织的蛋白质组学分析及hnRNP A1影响PEDV复制的作用机制研究[D];华中农业大学;2018年
2 周兴东;在细胞超微结构水平上研究氯喹及PEDV对自噬的影响[D];东北农业大学;2017年
3 王兴叶;猪流行性腹泻病毒高增殖Vero细胞选育、分离鉴定及致肠道靶细胞SIEC病理机制研究[D];西北农林科技大学;2018年
4 赵鹏伟;猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及生物学特性研究[D];中国农业大学;2018年
5 王翠玲;PEDV病毒样颗粒的构建与免疫原性研究[D];石河子大学;2017年
6 曹丽艳;猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFN-β产生及激活NF-κB机理研究[D];东北农业大学;2015年
7 孙瑞芹;华南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学与病原学研究[D];西北农林科技大学;2014年
8 施雯;丝氨酸蛋白酶对猪流行性腹泻病毒S蛋白的作用及其对病毒繁殖的影响[D];东北农业大学;2017年
9 叶十一;二维类石墨烯材料抗病毒机理研究[D];华中农业大学;2016年
10 陈建飞;猪流行性腹泻病毒全基因组序列分析及感染性cDNA克隆的构建[D];中国农业科学院;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡晓霞;携带不同ORF3基因的猪流行性腹泻病毒的拯救及其在VERO细胞上的增殖特性研究[D];上海海洋大学;2018年
2 张雪;慢病毒载体纳米抗体库构建及抗PEDV基因筛选[D];西北农林科技大学;2018年
3 郑常龙;猪肠道抗PEDV乳酸菌株筛选及其体外抗病毒作用[D];河北农业大学;2018年
4 沈立;用于高效增殖PEDV病毒的Vero细胞系的构建[D];吉林大学;2016年
5 孙立旦;趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用[D];河北农业大学;2018年
6 杨意;PK-15细胞中与PEDV E蛋白互作蛋白的鉴定及对病毒释放的影响[D];浙江理工大学;2018年
7 曲佳丽;CD26/DPP4对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中复制的影响[D];吉林大学;2018年
8 汪怿旸;致猪腹泻病毒快速检测方法研究及分子流行病学调查[D];扬州大学;2018年
9 赵喜文;PEDV感染介导Vero E6细胞差异表达磷酸化蛋白筛选及功能解析[D];黑龙江八一农垦大学;2018年
10 王恩雨;2015-2016年中国猪流行性腹泻病毒S1基因分子流行病学调查及病毒分离与鉴定[D];黑龙江八一农垦大学;2018年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026