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《华中农业大学》 2017年
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安卡拉病亚单位疫苗的初步研究和传染性法氏囊病毒样颗粒的制备

张丹  
【摘要】:安卡拉病是一种高度接触性传染禽病,主要感染3-6周龄肉鸡,死亡率为20-80%。病鸡突然死亡,解剖死亡鸡可见大量心包积液,肝脏肿大发黄、出血点,脾脏肾脏肿大充血,因此该病又被称为心包积水肝炎综合征。安卡拉病毒属于禽腺病毒科Ⅰ亚群血清4型(FAdV-4),病毒粒子无囊膜仅由核酸和核衣壳组成。该病毒的核衣壳主要由240个Hexon、12个Penton和12根Fiber组成。Penton和Fiber2(Fiber的头节区)是其重要的免疫原性基因,它们均可与细胞表面的病毒受体结合,在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种接触性传染禽病。该病易发于3-6周龄鸡群,可直接导致感染鸡群较高的死亡率,间接导致感染鸡群出现长期、严重的免疫抑制。其主要特征是法氏囊肿胀、出血后迅速萎缩。病鸡的肾脏、脾脏、淋巴结、法氏囊等重要的免疫器官受到严重损害。传染性法氏囊病毒是双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科。IBDV颗粒是30-60nm的20面体立体对称结构。病毒粒子无囊膜,仅由核酸和核衣壳组成。病毒核衣壳的外壳几乎均由VP2蛋白组成,VP2蛋白是IBDV重要的的结构蛋白和功能蛋白。同时,VP2基因也是IBDV的主要的免疫原性基因。安卡拉病与传染性法氏囊在易感鸡日龄、发病率、潜伏期、病死率以及对免疫力所造成的重大损害等方面都极其相似。安卡拉病的感染导致免疫系统受到严重损害,而提高鸡群对传染性法氏囊的易感性。传染性法氏囊导致感染鸡群产生长期、严重的免疫抑制而易与安卡拉病毒混合感染。安卡拉病和传染性法氏囊不仅容易混合感染而且会提高鸡群对禽流感、新城疫、传染性贫血病、传染性支气管炎等病毒性疾病和大肠杆菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌等细菌性疾病的易感性。然而目前市场上没有安卡拉病的商业化疫苗,为防治安卡拉病和传染性法氏囊,降低养禽业所遭受的重大损失和危害,本文的主要研究内容如下:1.Ac-Penton,Ac-Fiber2,Ac-VP2三株重组杆状病毒的构建利用杆状病毒昆虫细胞表达系统,分别将Penton,Fiber2基因克隆到pFastBac HTb载体,将VP2基因克隆到pFastBac1载体。得到正确的重组质粒后转化DH1OBac,经四种抗性和蓝白斑筛选得到正确的重组杆粒Bacmid-Penton,Bacmid-Fiber2,Bacmid-VP2。分别将三种重组杆粒转染 Sf9细胞,3-5d可观察到明显病变,获得三株重组杆状病毒Ac-Penton,Ac-Fiber2,Ac-VP2。2.Penton,Fiber2,VP2三种蛋白的表达鉴定及优化和纯化将得到的三株重组毒分别接种健康Sf9细胞,3天后观察到病变,收集样品。利用Western blot和间接免疫荧光实验对Penton,Fiber2,VP2三种蛋白的表达进行鉴定,并对蛋白表达条件进行优化摸索出最小接毒剂量。然后,对三种蛋白进行大量的表达和纯化。3.Penton,Fiber2相关亚单位疫苗的制备和初步研究将Penton,Fiber以及两者的等量混合物分别与佐剂ISA 71 VG按质量比3:7混匀制成疫苗,分别免疫SPF鸡。攻毒实验表明三种疫苗都能对安卡拉病达到100%的保护率。肝脏及心脏的病变观察和组织切片观察均可表明三种疫苗有很好的免疫保护效果。并且三种疫苗都能刺激免疫鸡产生高效持久的抗体,其中以Penton蛋白为抗原的疫苗刺激鸡产生的抗体效价最高,保持阳性抗体时间最长。4.传染性法氏囊病毒样颗粒的纯化及电镜观察在Sf9细胞中大量表达VP2蛋白,浓缩细胞样品和培养基上清中的传染性法氏囊病毒样颗粒,然后进行蔗糖密度梯度离心。Western blot实验表明传染性法氏囊病毒样颗粒在蔗糖密度梯度为30%的条带中。取相应条带脱糖处理,负染后,可在电镜下观察到30-60nm,形态完整规则的病毒样颗粒。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S858.31

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