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铜离子及维生素C对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑杀作用研究

陈元元  
【摘要】:水体富营养化和蓝藻水华频繁暴发是当前国内外迫切关注的生态问题,蓝藻水华及其次级代谢物对水生动物和人类健康安全构成了巨大威胁,蓝藻水华的防控技术成为当前研究的热点。铜制剂是一种经典的除藻剂,然而关于其杀藻机理及蓝藻在铜离子胁迫条件下的响应机制有待进一步深入研究。尽管铜制剂具有除藻效率高、价格便宜等特点,但是铜离子在除藻过程中造成的二次污染问题引起人们的关注,寻找高效环保的除藻剂以控制蓝藻水华显得尤为重要。本研究以蓝藻水华中最为常见的产毒藻株铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa,M.aeruginosa)PCC 7806和M.aeruginosa FACHB 905为研究对象,研究铜离子抑杀M.aeruginosa PCC 7806作用机制,并研究铜离子胁迫条件对M.aeruginosa PCC 7806产毒机能的影响;还尝试寻找更为安全高效的除藻方法,开展了维生素C对M.aeruginosa FACHB 905的抑杀作用及其机制的研究。主要研究结果如下:1.使用不同浓度的铜离子暴露M.aeruginosa PCC 7806确定最小抑制浓度为0.5μM,铜离子对M.aeruginosa的96 h的半最大效应浓度(Concentration for 50%of maximal effect,EC50)为3μM。转录组学技术比较0.5μM和3μM铜离子处理组的样品中差异表达基因,3μM铜离子处理组相对于0.5μM铜离子处理组具有更多的差异基因,在3μM铜离子处理组中显著差异表达的基因有1306个,而在0.5μM铜离子处理组中显著差异表达的基因有52个。在两个铜离子处理组中金属转运体相关基因、铁硫簇相关基因、热休克蛋白(HSPs)基因以及藻毒素合成酶基因都差异表达。通过Gene Ontology consortium(GO)和KEGG对差异基因进行注释,在3μM铜离子处理组GO聚类分析中,差异基因富集于大分子复合物、膜蛋白复合物、光合作用、类囊体、氮化合物代谢等过程。KEGG通路富集分析表明,糖酵解及糖异生、次生代谢产物的合成、非核糖体肽合成、硫代谢、丙酸代谢、脂肪酸生物合成和代谢、光合生物碳固定、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等途径在两个铜离子处理组中均差异显著。差异表达基因的获得为深入研究铜离子抑杀铜绿微囊藻的机理奠定了基础。2.使用0.5μM和3μM铜离子暴露M.aeruginosa PCC 7806,研究了微囊藻毒素(Microcystins,MCs)水平与铜离子浓度之间的关系。结果表明,0.5μM和3μM铜离子处理M.aeruginosa细胞内MCs含量都显著增加。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测定了不同处理组M.aeruginosa细胞内的铜离子和铁离子含量。在0.5μM和3μM铜离子处理组中每个时间点M.aeruginosa细胞内的铜离子和铁离子含量都显著性上升。转录组数据显示在3μM铜离子处理组中的M.aeruginosa的转运铁离子和硫离子的相关基因转录水平均受到显著性影响。实时荧光定量PCR数据显示,在0.5μM铜离子处理组和3μM铜离子处理组中,不同暴露时间点的样品与对照组样品相比fur A基因、MCs合成酶基因的转录水平发生显著变化。通过凝胶迁移实验,发现调控铁离子吸收的Fur A通过与MCs合成酶基因mcy D的启动子区域结合,从而调控MCs的合成。因此,本研究认为过量的铜离子进入藻体细胞造成的铁硫簇失衡进而导致Fur A含量的变化,而Fur A通过与MCs合成酶基因mcy D的启动子区域结合,从而调控MCs的合成。3.以M.aeruginosa FACHB 905为研究对象,使用不同浓度的维生素C(0,0.12,0.6,3和6 mM)处理,发现随着维生素C浓度的升高,M.aeruginosa细胞的生物量逐渐减少,并且维生素C对M.aeruginosa的最低抑菌浓度为0.6 mM。0.6 mM的维生素C处理M.aeruginosa并测定不同时间点的藻细胞内的维生素C的含量,发现溶液中大量的维生素C进入藻细胞。ICP测定了上述样品中铁离子的含量,发现随着维生素C对M.aeruginosa处理时间的延长,藻细胞内的铁离子含量逐渐增加。同样检测了0.6 mM的维生素C处理M.aeruginosa的不同时间点的藻细胞内的亚铁离子的含量,结果表明M.aeruginosa样品细胞内的亚铁离子含量变化也显著地从0.8倍增加至4倍。0.6 mM维生素C处理的M.aeruginosa细胞在6,12和24 h样品的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的浓度分别显著性增加了1.43,3.62和3.15倍。这表明,维生素C进入藻细胞内催化M.aeruginosa细胞内Fenton反应发生,产生了大量的ROS。0.6 mM维生素C处理组与对照组相比,M.aeruginosa细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量、caspase-3蛋白活性等都显著升高,透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)结果显示随着暴露时间的增长M.aeruginosa细胞形态破碎严重。以上结果表明,过量的ROS诱导了M.aeruginosa细胞的caspase-3蛋白活性增强,脂质过氧化和膜变形从而导致M.aeruginosa的死亡。0.6 mM维生素C处理组M.aeruginosa细胞内、外的MCs含量随着暴露时间的增加而减少。这表明维生素C催化M.aeruginosa细胞内Fenton反应的发生产生的大量ROS,并不会使藻体产生以及释放更多的MCs。


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