伪狂犬病毒G_2-四链体可形成序列分布分析与功能探索

【摘要】：伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒,是危害生猪养殖产业的重要病原,给我国造成了极大的经济损失。近年来,中国北部和东部地区接种Bartha-K61疫苗的农场相继出现疫情,已证明Bartha-K61疫苗已无法提供完全有效保护。G-四链体是由富含鸟嘌呤的序列形成的特殊核酸二级结构,能够在基因的复制、转录和翻译过程中发挥重要作用。G-四链体结构存在于许多病毒基因组中,影响关键蛋白的表达,从而影响病毒的生活周期,稳定G-四链体的配体小分子对病毒呈现了一定的抑制效果。PRV基因组中有极高的GC含量,可形成大量G-四链体的序列,有望影响PRV与宿主的相互作用。研究G-四链体可形成序列(PQS)在PRV生命周期中的作用,有望为PRV的疫苗研究提供思路。G_3-四链体通常以G_(3+)N_(1-7)G_(3+)N_(1-7)G_(3+)N_(1-7)G_(3+)序列模式存在。其中G是鸟嘌呤,N是包括G的任何核苷酸。而G_2-四链体通常以G_(2+)N_(1-7)G_(2+)N_(1-7)G_(2+)N_(1-7)G_(2+)序列模式存在。G_2-四链体相较于G_3-四链体,少了一个G平面,因此对细胞微环境更敏感。与广泛研究的G_3-四链体相比,动态G_2-四链体分布更加丰富。G_2-四链体的系统分析有望揭示疱疹病毒中富含G序列的更多功能。本论文具体工作如下:1.PRV G_2-四链体可形成序列(G_2-PQS)生物信息学分析1)分析G_2-PQS在PRV基因组中分布:通过Quadparser program分析G_2-PQS在PRV基因组中分布,发现G_2-PQS在全基因组中广泛分布。在UTR区域中,3’UTR区域相较于5’UTR区域具有更高的G_2-PQS密度;2)评价PRV中G_2-PQS的保守性:将Varicellovirus不同病毒的相同基因进行比对后发现,PRV CDS中12个G_2-PQS的保守性评分高于0.7。PRV不同毒株中,IE180和US1之间的重复区域中的38个G_2-PQS,表现出高于90%的保守性;3)预测有功能的G_2-PQS:参与调控基因表达、基因组DNA复制和病毒成熟过程的基因,在其miRNA序列中具有丰富且保守的G_2-PQS。LLT内含子具有microRNA簇,含有的15个G_3-PQS和35个G_2-PQS可能参与PRV潜伏期间microRNA的转录调节。2.G_2-四链体结构、功能实验验证1)体外结构分析:通过圆二色谱验证预测的G_2-PQS可以在体外形成G-四链体结构,并研究K~+、Na~+和G-四链体配体小分子NMM对G_2-四链体结构的影响。结果发现NMM和K~+更有利于G_2-PQS形成G-四链体结构;2)体外功能分析:基于体外结构研究的结果,进行了G_2-四链体功能的研究,包括采用双荧光素酶验证3’UTR中G_2-四链体对基因表达的调控作用(UL9-3’UTR中G_2-PQS可以抑制基因的表达;UL5-3’UTR中的G_2-PQS对于基因的表达起促进作用),以及G_2-PQS对miRNA与mRNA相互作用的影响(非种子序列配对区的G_2-PQS目前没有表现出对UL5-3’UTR与PRV-miR-LLT3相互作用的影响);3)病毒水平:通过蚀斑实验,初步验证G-四链体配体NMM对PRV病毒具有抑制作用。本论文预测的G_2-PQS为G-四链体在病毒中的功能研究奠定基础;离子和配体对G_2-四链体结构的影响便于以后开展环境调节G_2-四链体功能的系统性研究;3’UTR中G_2-PQS的功能研究为以后开发PRV疫苗提供思路;病毒水平上的研究表明G-四链体配体具有很大的抗病毒潜力。