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ICP-MS单细胞分析睾丸酮丛毛单胞菌胞内生成硒纳米粒子的研究

韩毓杰  
【摘要】:细胞是相对独立的生命基本单位,同一类型的细胞代谢途径基本相同。一般而言,研究细胞生长的基本规律,主要途径为观察整个细胞群的生长状态。由于微环境的差异,往往存在“细胞异质性”现象。对于单细胞分析技术而言,它的优势在于能对细胞的生理状态获得更加全面的信息。以电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)为主要手段的单细胞分析方法在单个细胞的元素检测上提供了解决途径,事实上,ICP-MS单细胞分析已在药物的检测、毒理检测等方面体现了它的能力。本文利用ICP-MS分析了单个C.testosteroni S44细胞中的硒元素含量与分布状态。其中菌株S44细胞可以还原亚硒酸钠(Se(Ⅳ)),并在胞内生成硒纳米粒子(BioSeNPs),通过添加亚硒酸钠对菌株S44的培养与优化,利用得到的含纳米粒子的细胞进行了ICP-MS的单细胞分析实验。主要研究内容与结果如下:(1)胞内硒纳米颗粒的生物制备。通过对菌株S44培养条件的探索,我们发现其在28℃、摇床转速150r/min、接种比例为1%、培养液体积为100mL、Se(Ⅳ)浓度为0.2mmol/L的条件下得到了球形的硒纳米颗粒,尺寸分布在50-300nm,Se(Ⅳ)的还原效率最高为51.3%。证实了在Se(Ⅳ)浓度为2mmol/L的条件下BioSeNPs绝大多数位于细胞内,并将此类型的细胞用作ICP-MS单细胞分析的材料。除此之外,红外光谱等手段证明了菌株S44在还原Se(Ⅳ)的过程中有相应蛋白与多糖物质的产生。(2)胞内硒纳米颗粒的优化制备。在确定菌株S44的单因素培养条件后,我们对培养基进行了优化。探究了不同的添加剂对还原反应的影响,包括牛血清白蛋白(BSA)、壳聚糖(CTS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP),它们与培养基比例最佳依次为1:4、1:10、1:8,并且添加BSA后Se(Ⅳ)的最大还原率达到了62.3%,产物的量明显增多,分泌的蛋白等物质增多,在Se(Ⅳ)浓度为2mmol/L的条件下,只有PVP添加剂的培养得到的BioSeNPs在胞内。(3)ICP-MS分析单个C.testosteroni S44细胞。我们将ICP-MS单细胞分析能力应用于单个C.testosteroni S44细胞中的硒纳米粒子检测。确定了0.1ms为最佳的分辨时间,用阳离子交换树脂(CER)处理细胞,细胞的进样合适浓度为5×10~5个/mL,结合数学统计分析,积分分析,使ICP-MS的时间分辨数据比较详细的体现出还原产物的情况,并尝试用单个BioSeNPs对胞内的BioSeNPs进行定性分析,通过透射电镜的辅助观察,证实模拟程度较好。


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