15个猪品种MHCⅡ类区4个基因的SNPs分析及与免疫性状的关联

【摘要】： 主要组织相容性复合体(MHC)是一群紧密连锁的基因，编码主要组织相容性抗原，在脊椎动物机体的免疫应答中具有重要作用。MHC中的基因具有丰富的多态性，是物种起源、进化和动物抗病育种的研究重点之一。本研究运用比较基因组策略成功获得了位于猪7号染色体上MHC Ⅱ类区中SLA-DRA和SLA-DQA基因的2-3外显子的片段(包括第2外显子、第2内含子和少部分第3外显子)，采用PCR产物直接测序法研究中外15个猪品种MHCⅡ类区中SLA-DRA、SLA-DQA、SLA-DRB和SLA-DQB基因第2外显子的核苷酸序列，分析了SNPs位点，发现了一批新等位基因，研究了各基因在15个品种中的遗传多样性及品种间的亲缘关系。采用PCR-RFLP方法检测了SLA-DQB、SLA-DRB基因第2外显子在通城猪、大长通和长大通3个群体中的多态性，对基因与免疫性状的关系进行了统计分析。其结果如下： 1、运用比较基因组策略成功设计了扩增猪MHCⅡ类区中SLA-DRA和SLA-DQA2-3外显子的引物对(DRAp167、DRAp428和DQAp161、DQAp443)，获得了包含大部分第2外显子、全部第2内含子和少部分第3外显子的SLA-DRA基因的705 bp和SLA-DQA基因的731 bp的片段，分别通过克隆和PCR产物的直接测序获得SLA-DQA和SLA-DRA的2-3外显子的核苷酸序列，分析了两基因部分片段(2-3外显子)的基因结构。推导出SLA-DRQ链、SLA-DQα链的α_1结构域的长度分别为85和87个氨基酸残基。 2、运用PCR产物直接测序方法进行了中外15个猪品种(13个本国地方品种，2个国外品种)的SLA-DRA、DQA、DRB、DQB 4个基因第2外显子和SLA-DRA、DQA 2个基因第2内含子的序列分析。发现SLA-DRA第2外显子231bp中存在3个SNPs位点，分别是190(G/A)，363(C/A)，374(C/T)，第2外显子中的SNPs发生频率为1.3％；在第2内含子中有6个SNPs位点存在，分别是114(C/T)、127(C/T)，228(C/G)，346(G/T)，414(G/A)，428(G/A)，SNPs发生率为1.4％。发现SLA-DQA基因第2外显子251bp中存在26个SNPs位点和2个突变位点(360A/G，373G/A)，其中有1个3态和1个4态SNP位点，SNPs频率12％，其SNPs的分布为：198(C/T)、203(C/A)、211(A/T)、230(C/T)、237(G/C)、245(C/T)、256(A/G)、276(C/A)、277(A/G)、293(C/T，C/A)、294(A/G)、301(C/G)、314(G/A)、332(C/T)、339(A/G)、340 华中农J匕大学俘士学位论文 (C厅)、342(G厅)、343(C瓜C/G)、348(C厅)、349(A/T)、352(AjC)、353(T/C)、 362(C/T)、363(G/C，G/A，G厅)、367(T/C)、374(T/C)。在第2内含子中发现以6 个核普酸和9个核营酸为单位的插入、缺失突变。发现￡丈月一DRB基因第2外显子1 74bp 中出现29个SNPs位点，其「万护有6个3态和l个4态，SNPs发生频率16.7%，其SNPs 的分布为:112(T/G)、113(T/A)、114(T/C)、115(C/A)、118(G/T)、119(G/T、 G/A)、124(T/G)、125(T/C、T/A)、144(T/C)、155(A/G)、165(A/G)、166(T/A)、 169(G/C)、171(G/C)、173(G/A)、177(A/C、AjG、A/T)、196(T/C/、T/A)、198 (T/A)、199(G/T)、210(C/T)、225(G/A)、240(C/T)、255(A/T、A/G)、256(G/T)、 257(A/C、A/T)、265(A汀、A/G)、269(A/G)、270(AjG)、278(A/G)。发现S丈月一DQB 第2外显子204bp中有5个突变位点和3个SNPs位点，其中2个3态SNPs位点，SNps 发生频率为15.7%，SNPs分布为:243(A/G)、245(A/G)、246(A/G)、247(AjG)、 257(A/G)、265(T/C)、266(A/T)、267(T/C)、268(G/T)、269(C/T)、283(G/A)、 286(G/A)、294(G/A)、296(A/T)、3 12(T/G)、325(G/A)、326(C/A)、327(C/G)、 335(A/C)、338(G汀)、343(A/G)、354(C/G)、355(A/G，A/T)、356(T/C)、357 (C/T)、368(C/A、C厅)、375(A/C)、379(C/G)、386(C/G)、387(G/T)、418(G/A)。 3、通过对GenBank中同一基因的序列比对，按读码框分析氨基酸序列，发现一批 新等位基因。其中在S乙月一DRA中发现2个新等位基因，分别命名为S丈减一DRA 001、 S乙月一D尺月002。S乙月一DRAO01是由于190位(G/A)变异引起83位氨基酸的改变(Ser一 Asn)，S乙月一DRA 002是由363位(C/A)核普酸变异引起%位氨基酸改变(Leu一Met)。 分析S丈月一DRA基因在物种间的变异时，发现占丈月一DRA002在物种间表现出保守性，在 猪以外的9种哺乳动物中该位点均为Met，而在猪中存在Met和Leu两种氨基酸残基变 异。也发现基因￡乙注一DQA中有4个新等位基因，分别命名为￡丈刁一DQA001沼丈左一DQAO02， s乙月一DQA003，召乙月DQA004，其中S乙月一DQA001是92位Ala一Val的变异，‘乙月一DQAooZ 是92位Ala一Ser的变异，5去月一DQA003是94位His一Tyr的变异，占丈月DQA004是99 位Ala一Met的变异。发现基因S丈月一DRB有1个新等位基因，该等位基因是由“位Phe ~Leu的突变而产生。发现基因SLA一DQB有7个新等位基因，其命名从￡乙月一DQBool 到s乙月一DQ刀007，它们的核昔酸变异依次引起62位(Tyr一Cys)、63位(Ile一Met)、70 位(Ala一Ser)、89位(Ala~Asn)、97位(Lys一Arg)、1 07位(Leu一Ala)和1 09位 (Thr~Ser)的氨基酸发生改变。 1曰宁1............—一 巧个猪品种MHCH类区4个基因的SNPs分析及与免丧性状的关联 4