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《华中农业大学》 2003年 硕士论文
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根癌农杆菌介导转化鄂抗棉9号愈伤组织获得含Chitinase和β-(1,3)-glucanase基因的棉花再生植株

李忠  
【摘要】: 棉花(Gossypium hirsutum)是世界性的重要经济作物,在我国栽培面积较大,年种植面积达400万公顷,为我国农村经济的发展做出了重要贡献。而棉花的生产受到多种病原真菌的危害,随着种植面积的增加,棉花真菌病害在我国主要棉区迅速蔓延,严重影响了棉花的生产,造成了巨大经济损失。由于难以找到棉花抗源,因而利用广谱性抗真菌基因被认为是一个被看好的研究策略。几丁质酶和β-(1,3)-葡聚糖是绝大多数病原真菌细胞壁的组成成分,几丁质酶和β-(1,3)-葡聚糖酶通过降解病原真菌细胞壁达到抑制病原真菌的目的。 本试验利用根癌农杆菌介导的转基因方法,将双价抗真菌基因几丁质酶基因(Chitinase)和β-(1,3)葡聚糖酶基因(Glucanase)导入鄂抗棉9号胚性愈伤组织,结果表明: 1.IBA和KT及无机盐对鄂抗棉9号下胚轴再生有重要影响。在1.0mg/l IBA和0.5mg/l KT时为最佳配比,在愈伤组织诱导和增殖期间,培养基中分别添加120mgl~(-1)的硫酸镁和42mgl~(-1)硫酸亚铁,使愈伤向胚分化方向发育。在诱导愈伤时NH_4NO_3是不可缺少的,否则体细胞难以分化再生,但向胚性愈伤转变时,NH_4~+必须撤去,同时补加1900mgl~(-1)的KNO_3,KNO_3能促使胚的分化;到胚分化生长成苗时,需附加谷氨酰胺和天门冬酰胺,分别为1000mgl~(-1)和500mgl~(-1),可以增加胚分化率和利于胚生长。 2.优化了根癌农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织转化体系。以鄂抗棉9号愈伤组织为外植体,对转化的几个重要参数,如预培养的有无,共培养温度,乙酰丁香酮的有无,卡那霉素的选择浓度进行了筛选。结果表明:预培养5-10天较没有预培养的愈伤表现出更强的转化效率;共培养温度以19℃为适宜温度;使用乙酰丁香酮和不使用乙酰丁香酮效果不明显;卡那霉素的选择浓度以100mg/l为宜。 3.获得了60株抗性小苗,随机选取20株做PCR检测,有14株检测结果为阳性,取6株PCR阳性植株进行Southern检测,结果表明外源基因已经整合到棉花基因组中,拷贝数由1到3个不等。 4.对海岛棉的再生进行了初步研究。实验表明:2,4-D 0.15mg/l/KT 0.5mg/l时为新海14心形胚的诱导的最佳组合。


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