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猪12号染色体显微切割与微克隆研究

赖健耀  
【摘要】: 本实验以广西巴马小型猪为材料,采用单条染色体显微切割及微克隆方法,建立了猪12号单染色体微克隆文库,并对克隆子进行了分析。它将为获得位于猪12号染色体上的探针,建立12号染色体上高密度分子标记连锁图谱以及克隆与分子标记紧密连锁的重要基因奠定基础。本研究的主要内容及结果如下: 1.猪12号单染色体微细玻璃针法显微切割及其体外扩增实验体系的建立。用微细玻璃针法将猪淋巴细胞中期分裂相单条12号染色体挑出放入Eppendorf管中,经蛋白酶K消化及Sau3A Ⅰ酶切后,与Sau3A Ⅰ接头连接,并用Sau3A Ⅰ接头介导的PCR(linker-adaptor PCR,LA-PCR)进行两轮体外扩增。鉴定结果表明,扩增片段长度在250-1600bp之间,经Southern杂交分析证明,所扩增片段来自猪基因组。与前人报道相比,本实验体系微分离染色体精确,易于操作,且费用较低。用显微切割法微分离与微克隆猪12号单条染色体在国内外尚未见类似报道 2.利用两对猪12号染色体上特异性微卫星探针引物SW2559和S0090对扩增产物来源进行验证,证实扩增产物来源于猪12号染色体。同时从另一方面也证实染色体微克隆文库中含有大量微卫星序列,具有开发微卫星探针的潜力。 3.猪12号单染色体探针池的建立。采用上述实验体系,对经接头介导的经PCR扩增获得的猪12号单染色体DNA进行克隆,建立了猪12号单染色体DNA文库。对其中随机挑选的克隆子进行分析表明,插入片段大小主要分布在250-1600bp,平均大小在500bp左右。该微克隆文库可提供大量猪12号染色体特异性探针,为该染色体高密度遗传图谱及精细物理图谱的构建,以及一些重要基因的分离奠定了基础。同时,该实验体系可为同类研究提供研究经验 4.从已建立的猪12号染色体微克隆文库中的克隆子中获得一个含12个(GT)的微卫星序列,


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