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《华中农业大学》 1998年
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苹果原生质体培养再生及融合研究

潘增光  
【摘要】: 苹果是我国重要的果树栽培树种,但单产低、品质差,严重影响着苹果生产的发展。通过育种手段选育优良的品种和砧木是解决存在问题的重要途径。原生质体培养及融合技术能扩大遗传重组范围,促进远缘性状的有效转移,在应用于育种实践时显示出巨大的应用潜力。在苹果原生质体培养融合研究中,目前仅有再生成株的报道,且再生基因型也有一定的局限性。进一步开展苹果原生质体培养融合技术的研究,对于创造新种质材料,促进原生质体技术在苹果品种和砧木遗传改良中的应用将具有重要的意义。 本试验由苹果不同种类及不同外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞系,对影响苹果叶肉及悬浮细胞系原生质体分离、培养及再生的因素进行了系统的研究;并利用电融合法进行苹果原生质体融合及培养再生的工作。主要研究结果如下: 1.建立起了由苹果幼嫩胚珠、成熟胚及叶片诱导愈伤组织的技术体系。不同激素配比对愈伤组织的诱导具有明显的差异。将诱导出的愈伤组织在继代培养基上经不断选择,可以得到松散颗粒状类型。其中由叶片诱导产生的愈伤组织能够出现形态分化。本试验诱导出了平邑甜茶、山定子、三叶海棠、珠美海棠、M_7、M_(26)、MM_(106)、庐山海棠、CG80、北海道9号、嘎啦、垂丝海棠等12种基因型的愈伤组织。 2.优化了悬浮细胞系培养及再生的条件。培养基中蔗糖浓度、氮素营养调节、不同激素组成等均对悬浮细胞系的生长产生影响。低浓度2,4-D的使用对建立稳定松散的悬浮细胞系是必需的。由叶片愈伤组织建立的悬浮细胞系具有形态分化的潜力。建立起了10种基因型的稳定悬浮细胞系。 3.由M_7叶肉分离原生质体的试验表明,在1.0%的酶浓度范围内,随果胶酶浓度升高,原生质体活力下降,而产量以0.5%或0.75%浓度时高;随纤维素酶浓度升高,原生质体产量及活力增大。明确了BSA(牛血清白蛋白)在稳定原生质体活力方面的作用。优化的叶片及子叶酶解液组成为:CPW 12% 甘露醇+MES 0.1%十PVP 1 .0%十纤维素酶1 .0%十果胶酶Y一23 0.05%;悬 浮细胞系酶解液组成为:CPW13%甘露醇十MES 0.1%+纤维素酶0.5一1 .0% +果胶酶0.3一0.5%。在原生质体纯化过程中,采用短时间离心、上浮法界面 纯化可以获得较好的效果。 4.优化的原生质体培养基条件为:改良MT十Vc sm叭十2,4一D 0.2 mg飞 +0.65 movL蔗糖+谷氨酞胺soom目1+CH 100 mg/L+ME 500 mg/L;以葡 萄糖代替蔗糖作渗透压调节物质效果好,且在培养过程中不需降压;适宜的低 密度培养(0 .5 x 1051而)可减少褐变。在以上条件下,悬浮系原生质体培养5一6 d出现第一次细胞分裂,巧一ZOd形成多细胞团,40一50d形成肉眼可见的小 愈伤组织。叶片及子叶原生质体培养未获得多细胞团。将形成的小愈伤组织转 至固体培养基上促进增殖。由平邑甜茶、呱、峡6、入丑吸106、CG80、庐山海棠、 珠美海棠、嘎啦、北海道9号、山定子等10种基因型的原生质体再生了愈伤 组织。 5,对不同基因型的原生质体再生愈伤组织进行状态调控,能使愈伤组织 紧密化。转至第一分化培养基,经二次继代后诱导出绿色芽点,及时转至第二 分化培养基后绿色芽点长成绿色硬块,继而发出不定芽。由不定芽诱导出根长 成完整植株。本试验到目前获得了平邑甜茶、M26、嘎啦三种基因型的原生质 体再生植株。 6.对原生质体再生愈伤组织及悬浮细胞系的染色体观察表明,再生愈伤 组织及悬浮细胞系的染色体倍性稳定性对原生质体再生愈伤组织的形态分化 有很大的影响,这也可能是造成原生质体培养再生中基因型差异的重要因素。 7.进行了悬浮细胞系亲本原生质体与叶肉亲本原生质体、悬浮细胞系亲 本原生质体间的融合研究。利用平邑甜茶悬浮细胞系原生质体与北海道9号叶 肉原生质体为亲本进行融合,优化的电融合参数为:交流电压强度100 V/cm, 作用时间605;直流脉冲电压次数5次,强度1250 V/cm,作用时间50哪。对 融合后的原生质体进行低密度培养(0 .5 x 105/ml),8一10d观察到第一次细胞分 裂,40一60d观察到肉眼可见的小愈伤组织。在低密度培养及控制其它培养条 侧几F,可分离得到不同的细胞系。经状态调控,细胞系可形成脆硬颗粒状愈伤 组织,还未获再生植株。 8.对融合后再生细胞系的POX同工酶检测结果表明,再生细胞系同工酶 出现了广泛的差异,并证实这些差异是由融合引起的。许多再生细胞系含有双 亲的特异同工酶带,有的表现为双亲谱带之和,表明在再生的单克隆细胞系中 存在杂种细胞系。染色体观察结果表明,融合后再生细胞系的染色体倍性发生 了很大的变化。融合造成了再生细胞系的高倍化及倍性嵌合。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1998
【分类号】:S661.1

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