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《华中农业大学》 1999年
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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白和辅助蛋白基因的克隆表达

刘子铎  
【摘要】: 鉴于苏云金芽胞杆菌杀虫剂在农林害虫防治中占有重要地位,国外相继研制出了不同的高效工程菌杀虫剂。然而,我国目前仍处于使用天然菌株进行发酵生产的落后状况。因此,本研究围绕进一步提高苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白产量和杀虫活性,构建工程菌这一主题,进行了以下两个方面的基础研究。 一、苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因在不同受体菌中的表达 1.将cryⅠ基因的高保守区的cryⅠA(a)Ecog Ⅰ-F片段插入带有T7 RNA聚合酶启动子的质粒pSELECT-1,获得了能在体外转录的RNA探针载体pBPL-1,用该载体制备的RNA探针具有特异强,背景清楚,省时省力等优点,已成功地用于苏云金芽胞杆菌的分子生物学研究和特异菌株的筛选。 2.利用cryⅠA(a)EcoR Ⅰ-F片段RNA探针和cryⅠ混合特异引物对本室筛选的苏云金芽胞杆菌菌株YBT803和YBT-791的质粒进行了基因杂交定位和基因型的PCR分析。并将携带有cryⅠA(b)和cryⅡ基因的38MDa质粒分别电转化到不同血清型苏云金芽胞杆菌无晶体突变株4D10(H_(3ab))和Bti IPS·78/11(H_(14))中,证明了相同基因型在不同血清型受体中有不同的杀虫活性。建立了一个利用电转化技术构建遗传改良工程菌的新模式。 3.将含有cryaⅠ因的苏云金芽胞杆菌YBT-803质粒的7.9kb和4.4kb片段与穿梭载体pX161重组,获得了大肠杆菌克隆株EL-1和EL-2。PCR分析表明7.9kb片段含有cryⅠA(b)基因,4.4kb片段兼有cryⅠA(b)和cryⅠA(a)基因型的特征谱带。对4.4kb片段进行了部分序列分析,绘出了基因上游650bp序列的精确酶谱。SDS-PAGE分析表明,EL~1和EL-2均可表达130kDa蛋白质。这一结果表明克隆的两个片段含有完整的结构基因,可直接用于构建基因重组工程菌和进一步的分子生物学研究。同时,将重组质粒pBL-1、pBL-2和pBL-3分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Bti IPS·78/11和4D10,获克隆株BL-1,BL-2和BL-3。通过SDS-PAGE分析和生物测定,证明了不同载体对表达产物稳定性及杀虫活性有直接影响。 4.为研究杀虫晶体蛋白基因在荧光假单胞菌中的表达特性,利用多寄主质粒pSUP106探索了不同CaCl_2浓度和细胞不同生长时期对转化频率的影响,建立了一个简便易行的转化方法,奠定了异源基因在荧光假单胞菌中克隆与表达研究的基础。 5.利用上述转化方法将苏云金芽胞杆菌YBT-791的cryⅠA(b)基因通过与pSUP106重组转化荧光假单胞菌Pfx-18,获得克隆株BPL-1。SDS-PAGE分析表明,克隆子BPL-1表达66kDa的蛋白质和一些小分子多肽。稀释1000倍发酵液对三龄小菜蛾幼虫的致死率为33%,这一研究奠定了构建杀虫抗病荧光假单胞菌工程菌的基础。 二、苏云金芽胞杆菌以色列亚种辅助蛋白基因的研究 1.根据NcoⅠ识别位点CCATGG含有结构基因起始密码ATG这一序列特征和苏云金 芽胞杆菌以色列亚种辅助蛋白川夕基因的序列,利用PCR定点诱变技术,通过A川n1i厅 程序设计一r一套分别含有万coI位点的特异引物,使扩增的基因正好处在表达载休启动 子控制下的正确阅读框内.这一重组技术克服了传统方法上结构基因起始密码处必须 具备合适的酶切位点才可以正确重组的限制,使得任何结构基因都可以进行重组并保 证结构基因不发生任何突变,作者用这一技术成功地克隆了能够正确表达的以色列亚 种辅助蛋白尸1夕基因,并对其进行了序列分析,确证了尸1丝吉构基因的正确性. 2.将p了夕和cy时基因以及它们重组休插人大肠杆菌表达载休pUHE一24,分别获得了 3种重组质粒PLZ19、pLZcytA和休21 gA.将重组质粒转化到不同大肠杆菌受休菌 xLI,DHS仪,获得了5种含有不同基因型的转化子.测定了不同转化子基因表达产物 与伪tA的相互作用对大肠杆菌受体菌生长的影响。发现了PI夕基因对cy“基因的表达具 有增效作用.这一发现在国际上尚属首次报道.它不仅对苏云金芽胞杆菌工程菌的构 建具有现实意义,而且对其它基因高表达研究将产生积极影响,具有一定的理论意义 和潜在的应用价值. 3.用上述重组技术获得了含有刀口基因的LZ20和含有尸2拼即“的LZ20A克隆株, 通过基因的诱导表达,发现p”和pZ浏民有不同的作用机制,证明了P20具有保护Cyt人 溶细胞的作用,这种作用并不依赖大肠杆菌受休的不同而改变. 4.把携带有苏云金芽胞杆菌核糖休结合位点的pZ窿因与pLzl gA重组.获得克隆 子Lzng-一20A和LZr19一20A.在IPTG诱导下,不管插人的尸2叹基因是正向还是反向,都 能保护Cyt人蛋白对大肠杆菌的致死作用.但是,其作用都弱于pLZZoA,表明尸1P基因 相对削弱了pZo和CytA之间的相互作用. 5.将以色列亚种pl夕和叮时基因的重组质粒转人大肠杆菌Mvl 190时,发现cy“基 因起始密码子区域缺失约30个碱基,导致CytA蛋白生物活性丧失,这种大肠杆菌细胞 使异源基因片段缺失的现象对异源基因表达异常分析具有指导意义。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1999
【分类号】:Q78

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 余子全;苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫蛋白进入根结线虫体内的模式[D];华中农业大学;2008年
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1 刘姣;苏云金芽胞杆菌Sigma35因子对杀虫晶体蛋白基因表达的影响[D];华中农业大学;2010年
2 刘金辉;杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究[D];华中农业大学;2011年
3 董方;苏云金杆菌嵌合杀虫蛋白的构建与毒性分析[D];华中农业大学;2012年
【参考文献】
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【共引文献】
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5 邓青;陈巨莲;程登发;孙京瑞;;转基因作物抗虫因子的研究进展[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
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1 杜立新;苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究[D];河北农业大学;2011年
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5 姚江;高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D];中国农业科学院;2002年
6 陈中义;多功能质粒载体与组合Bt杀虫蛋白基因工程菌研究[D];中国农业科学院;2002年
7 邵宗泽;苏云金芽胞杆菌帮助蛋白对杀虫晶体蛋白表达的影响[D];华中农业大学;2000年
8 吴志平;二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因的分子生物学研究[D];浙江大学;2002年
9 李林;苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能[D];华中农业大学;1999年
10 鲁松清;苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫广谱高毒基因工程菌的构建[D];华中农业大学;1999年
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1 邓雅丽;土壤中铁铝氧化物对Bt毒素吸附的影响[D];华中农业大学;2010年
2 侯守鹏;转Bt基因水稻对褐飞虱卵及其寄生蜂—稻虱缨小蜂的影响[D];浙江大学;2011年
3 赵丹;苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析[D];河北农业大学;2011年
4 冯頔;玉米诱导性启动子的克隆、表达载体构建及Bt基因转化大豆的研究[D];吉林大学;2011年
5 王一喆;小菜蛾高毒力苏云金芽胞杆菌的筛选与分子特性研究[D];华中农业大学;2011年
6 蒋善军;Cry1Ab和Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫及其寄生天敌的生态安全性评价[D];华中农业大学;2011年
7 刘金辉;杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究[D];华中农业大学;2011年
8 张小琼;利用DNA Shuffling技术改造抗虫Bt基因的研究[D];华中农业大学;2010年
9 田亮;苏云金芽孢杆菌S2160-1中cry30Ga2基因的鉴定和克隆[D];广西大学;2011年
10 郭巍;苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究[D];东北农业大学;2000年
【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 李林;苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能[D];华中农业大学;1999年
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1 徐宁;苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白(Vip3)突变体的杀虫活性及其对胰蛋白酶的敏感性[D];浙江大学;2007年
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【二级引证文献】
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1 赵新民;刘淑云;周攀登;徐玲;夏莉;夏立秋;成飞雪;;苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性[J];植物保护;2013年01期
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1 李红;苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2010年
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【相似文献】
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3 张春鸽;束长龙;高继国;宋福平;张杰;;高通量测序在苏云金芽胞杆菌基因发掘中的运用[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
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7 谈海亮 金安江;“转基因抗虫水稻品种培育”在华中农大启动[N];农民日报;2009年
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7 邵宗泽;苏云金芽胞杆菌帮助蛋白对杀虫晶体蛋白表达的影响[D];华中农业大学;2000年
8 吴岚;苏云金芽胞杆菌解离载体的构建及其特性[D];华中农业大学;2000年
9 周学永;苏云金芽胞杆菌喷雾干燥工艺和杀虫蛋白纳米材料吸附剂型的研究[D];华中农业大学;2004年
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3 关鹏;四川蒙顶山苏云金芽胞杆菌cry基因鉴定及其新型模式cry基因的克隆与表达[D];四川农业大学;2010年
4 舒正玉;重组苏云金芽胞杆菌WG-001环境安全性分析[D];华中农业大学;2003年
5 邵志会;苏云金芽胞杆菌的分批发酵动力学[D];华中农业大学;2004年
6 郎晓磊;肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
7 葛东华;苏云金芽胞杆菌MB-15菌株特性及其可湿性粉剂的研究[D];河北农业大学;2012年
8 吴怀光;利用Tn5401转座子构建解离载体并在苏云金芽胞杆菌中高效、稳定表达AiiA蛋白[D];华中农业大学;2004年
9 刘姣;苏云金芽胞杆菌Sigma35因子对杀虫晶体蛋白基因表达的影响[D];华中农业大学;2010年
10 何晓明;苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析[D];东北农业大学;2011年
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