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《华中农业大学》 1999年
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苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能

李林  
【摘要】: 本研究通过筛选苏云金芽胞杆菌受体菌和对受体菌电脉冲转化条件的研究,建立了一种苏云金芽胞杆菌的高频转化系统。分别用溴化乙锭诱变处理、逐级升温培养以及用SDS处理等三种方法对苏云金芽胞杆菌无晶体(Cry~-)和无质粒突变株进行了筛选研究。用限量培养基和42℃培养9株野生菌株,结果筛选到9株Cry~-突变株;继续升温至44℃来培养其中的三个Cry~-突变株,得到内生质粒被进一步消除的突变株。然后进一步升温至46℃来培养突变株BMB170,并用SDS处理,最终筛选到1株无内生质粒的突变株BMB171。对出发菌株YBT-1463和其无质粒突变株BMB171的部分形态、生理生化和遗传学特性进行的比较研究的结果表明,突变株BMB171不形成伴胞晶体,但在个体形态与菌落特征、对红霉素等10种抗生素的敏感性、对葡萄糖等19种碳源和谷氨酸等12种氮源的利用能力及生长性能与出发菌株YBT-1463无明显差异。用pHT3101等5种供体质粒电转化BMB171的效率比电转化YBT-1463的效率显著提高,而转化导入的3种外源质粒在BMB171中的稳定性也明显高于出发菌株YBT-1463。 对用电脉冲法转化苏云金芽胞杆菌受体菌BMB171优化条件的研究结果表明,采用SG溶液作电脉冲缓冲液,用10.0 kV/cm的脉冲场强和1次电脉冲(4.6ms),以及采用对数前期(OD_(650)约0.2~0.3)收获的受体菌,可以达到最高转化频率。转化频率随质粒pHT3101浓度的增加,在54.69pg/mL至3.50μg/mL范围内呈线性增加,随后达到饱和。 通过将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Aal、cry1Ac10和cry1Ca转移至不同质粒载体上,分别构建了重组质粒pBMB121L、pBMB9821L和pBMB986L,并分别导入无质粒突变株BMB171,筛选得到携带相应ICPs基因的重组菌株。 研究了苏云金芽胞杆菌Cry~-突变株和无质粒突变株BMB171的转化性能和表达性能。用pHT3101、pBMB3305、pBMB1736、pBMB671、pBTL-1和pHV1249等6种外源质粒电转化无质粒突变株BMB171的转化频率,分别是Bt-4Q7、Bt-4D10和Bti.IPS.78/11等3种常用受体菌相应最高转化频率的2~3500倍。无质粒突变株BMB171表达cry1Ac基因的表达量高于Bt-407,略低于Bt-4D10和Bti.IPS.78/11,而表达cry1Ca和cry3Aa的表达量高于这3种对照受体菌。对小菜蛾3龄幼虫和甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力测定结果表明,BMB171表达cry1Ac基因的杀虫毒力高于Bt-4Q7和Bt-4D10,略低于Bti.IPS.78/11;而BMB171表达cry1Ca基因的毒力高于这3种受体菌。 对转座子mini-Yn10在苏云金芽胞杆菌野生菌株YBT-1463及其无质粒突变株BMB171中的转座作用进行了初步研究。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:1999
【分类号】:Q933

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【引证文献】
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2 余子全;苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫蛋白进入根结线虫体内的模式[D];华中农业大学;2008年
3 钟春英;苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520内生质粒生物量的鉴定[D];华中农业大学;2010年
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1 刘金辉;杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究[D];华中农业大学;2011年
2 王茜;30株野生Bt菌株的大质粒谱分析及晶体蛋白毒杀美洲钩虫(Necator americanus)的活性鉴定[D];广西大学;2011年
3 鞠守勇;苏云金芽孢杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象与其内生质粒有关[D];华中农业大学;2006年
4 王莉;苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析[D];华中农业大学;2007年
5 董纯明;苏云金素合成基因簇的初步定位及苏云金素与杀虫晶体蛋白的协同作用[D];华中农业大学;2006年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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8 高峰;胡继超;卞赟;;国内外土壤水分研究进展[J];安徽农业科学;2007年34期
9 张立洋;邱晨;吴晓峰;马小蕊;缪勇;;秋花菜田节肢动物群落结构的研究[J];安徽农业科学;2009年14期
10 陈军;孙冬丽;缪有志;胡冰;邹珍友;;微生物农药的研究进展[J];安徽农业科学;2010年23期
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1 左广胜;郭玉杰;;苏云金杆菌β-外毒素的活性作用及评价[A];杀虫微生物[C];1992年
2 闫冰;罗绍彬;闫建平;王惠杰;;苏云金杆菌Tm13-14菌株晶体毒素及毒力特性[A];杀虫微生物[C];1992年
3 龙綮新;赵文玲;庞义;王章;;苏云金杆菌10个亚种的质粒DNA图谱分析和DX杀蚊晶体毒素蛋白基因在质粒上的定位[A];杀虫微生物[C];1992年
4 洪玉枝;刘子铎;潘学文;喻子牛;;从大肠杆菌克隆株中分离杀虫晶体蛋白的方法[A];杀虫微生物[C];1992年
5 管玉霞;陈世夫;李德臣;武秀兰;陈英杰;;B.S2362与BtH_(14)混用灭蚊幼虫的室内和野外试验[A];杀虫微生物[C];1992年
6 张增艳;吕泽勋;穆国骏;李会玉;;苏云金杆菌原生质体制备的新方法[A];杀虫微生物[C];1992年
7 王安福;陈少莲;韩佩娥;章剑林;桑金隆;;对苏云金杆菌库斯塔克亚种Bt_4菌株的研究[A];杀虫微生物[C];1992年
8 徐加生;郭朗蕉;;苏云金杆菌悬浮乳剂防治玉米螟施药技术探讨[A];杀虫微生物[C];1992年
9 黄丁山;李志胜;侯有明;;我国稻田昆虫天敌资源及其保护利用[A];食品安全的理论与实践——福建省科协第四届学术年会“食品安全与农民增收”分会场暨福建省农学会第五届青年学术年会论文集[C];2004年
10 刘芸;侯有明;;黄曲条跳甲种群的生态控制技术[A];食品安全的理论与实践——福建省科协第四届学术年会“食品安全与农民增收”分会场暨福建省农学会第五届青年学术年会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 沙莉;苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究[D];福建农林大学;2011年
2 李东;豆科树种根瘤和根瘤菌遗传多样性的研究[D];南京林业大学;2011年
3 张春辉;致病性大肠埃希菌ESBLs的基因检测与耐药性控制[D];西北农林科技大学;2011年
4 吴丹丹;苏云金芽胞杆菌YBT-1520热胁迫下的生理变化及差异蛋白质组研究[D];华中农业大学;2011年
5 杨亚军;棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因突变的鉴定与检测[D];南京农业大学;2010年
6 周思军;大豆抗虫基因转移及其转化系统优化研究[D];东北农业大学;2000年
7 檀建新;Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究[D];中国农业科学院;2000年
8 张杰;对鞘翅目害虫高毒力的Bt cry基因分离克隆和工程菌的构建[D];中国农业科学院;2000年
9 赵伟春;应用单克隆抗体评价稻田天敌的捕食作用——稻飞虱和弹尾虫单克隆抗体的制备及其应用[D];浙江大学;2001年
10 李长友;对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株B-Hm-16和B-Pr-88的分子生物学研究[D];东北农业大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邓雅丽;土壤中铁铝氧化物对Bt毒素吸附的影响[D];华中农业大学;2010年
2 魏强;水蚀导致的土壤储水和导水变化对红壤季节性干旱的影响[D];华中农业大学;2010年
3 薛妍;肠道菌对苏云金芽胞杆菌棉铃虫杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
4 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
5 刘姣;苏云金芽胞杆菌Sigma35因子对杀虫晶体蛋白基因表达的影响[D];华中农业大学;2010年
6 李红;苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2010年
7 付雪林;转Bt基因甘蓝的抗虫性研究[D];华中农业大学;2010年
8 马小蕊;几种生物农药对甘蓝田节肢动物群落的影响[D];安徽农业大学;2010年
9 薛雯雯;CGA-N46基因在枯草杆菌中的多顺反子表达及表达条件优化[D];河南工业大学;2010年
10 陈成;一株解淀粉芽孢杆菌产抗真菌物质的研究[D];华南理工大学;2010年
【同被引文献】
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1 陈涛;袁丽;邓海凡;;苏芸金杆菌伴孢晶体的大小和形态结构[J];电子显微学报;1986年04期
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3 周忠,马代夫;甘薯茎线虫病的研究现状和展望[J];杂粮作物;2003年05期
4 彭黎明,李丽娟,尹一兵;脉冲电场凝胶电泳及其应用[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2000年06期
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6 韩丽珍;王茜;谢柳;张文飞;李有志;方宣钧;;来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析[J];基因组学与应用生物学;2009年03期
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10 吴海珍,李莉,张惠展,刘和;荚膜红细菌接合转移系统的建立及优化[J];华东理工大学学报;2000年01期
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1 刘子铎;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白和辅助蛋白基因的克隆表达[D];华中农业大学;1999年
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3 黄必旺;苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究[D];福建农林大学;2005年
4 刘超;苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520全基因组序列的初步分析[D];华中农业大学;2007年
5 刘小锦;苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520基因组中TA系统的研究[D];华中农业大学;2008年
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1 林晓燕;绿色荧光蛋白基因标记苏云金芽胞杆菌及微量热特性[D];华中农业大学;2003年
2 黄哲;昆虫病毒重组增效蛋白的生物活性[D];湖南农业大学;2005年
3 鞠守勇;苏云金芽孢杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象与其内生质粒有关[D];华中农业大学;2006年
【二级引证文献】
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1 赵新民;刘淑云;周攀登;徐玲;夏莉;夏立秋;成飞雪;;苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性[J];植物保护;2013年01期
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1 王鹏霞;苏云金芽胞杆菌YBT-1518内生质粒pBMB0228的分离融合机制[D];华中农业大学;2013年
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1 李红;苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2010年
2 王茜;30株野生Bt菌株的大质粒谱分析及晶体蛋白毒杀美洲钩虫(Necator americanus)的活性鉴定[D];广西大学;2011年
3 韩冬梅;枯草芽胞杆菌BSn5中新型抑菌蛋白APn5的鉴定及性质研究[D];华中农业大学;2008年
4 王忠勇;一株杀线虫苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及其ICPs基因的克隆[D];湖南农业大学;2013年
5 熊静;利用蛋白质组学技术研究苏云金杆菌晶体蛋白Cry6Aa2对线虫的作用[D];湖南师范大学;2014年
6 秦旭;纳米几丁质酶的制备及对苏云金芽胞杆菌杀虫的增效作用[D];华中农业大学;2014年
【二级参考文献】
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3 刘孟英;昆虫信息素研究及应用的新进展──欧洲及发展中国家信息素工程学术讨论会概况[J];昆虫知识;1994年01期
4 李典谟,张知彬;农业虫鼠害的严重性及防治对策[J];中国科学院院刊;1993年03期
5 李林,刘子锋,孙明,喻子牛;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因表达的调控(综述)[J];农业生物技术学报;1998年01期
6 晓岚;农用生物农药展望[J];农药译丛;1994年02期
7 沈寅初,杨慧心;杀虫抗生素Avermectin的开发及特性[J];农药译丛;1994年03期
8 刘志成;张淑芝;鲁迎新;李秋云;;扩展青霉原生质体的形成、再生及其影响因素[J];微生物学杂志;1989年02期
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【相似文献】
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2 鲁松清,孙明,喻子牛;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类[J];生物工程进展;1998年05期
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4 吴岚,孙明,喻子牛;利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1 Ac10基因的解离载体[J];微生物学报;2000年03期
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6 王清锋,喻子牛;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1E的改造[J];华中农业大学学报;1998年05期
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10 周琴,孙明,李林,杨在清,喻子牛;苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的构建与杀虫基因水平转移[J];应用生态学报;2005年01期
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4 何晓明;刘晓垒;陆琼;束长龙;张永军;张杰;宋福平;;苏云金芽胞杆菌中新型vip3基因的克隆与活性分析[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
5 喻子牛;孙明;刘子铎;戴经元;陈亚华;;苏云金芽胞杆菌Cry基因命名十年的进展[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
6 刘小锦;朱晨光;王莉;孙明;喻子牛;;苏云金芽胞杆菌AiiA蛋白的活性[A];廿一世纪微生物学发展前沿与应用新技术研讨会论文摘要集[C];2003年
7 孙明;;苏云金芽胞杆菌YBT-1520的功能组分析[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
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9 乐超银;孙明;喻子牛;;苏云金芽胞杆菌广谱、遗传稳定工程菌的构建[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
10 谭芙蓉;唐雪明;;四川生态区苏云金芽胞杆菌资源的筛选鉴定及其新型杀虫基因的克隆表达研究[A];第二届上海市植物生理学青年学术研讨会论文摘要集[C];2008年
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3 李晓云;农科中心的留美博士[N];人民政协报;2005年
4 谈海亮 金安江;“转基因抗虫水稻品种培育”在华中农大启动[N];农民日报;2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘子铎;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白和辅助蛋白基因的克隆表达[D];华中农业大学;1999年
2 李林;苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能[D];华中农业大学;1999年
3 鲁松清;苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫广谱高毒基因工程菌的构建[D];华中农业大学;1999年
4 周琴;绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达与应用[D];华中农业大学;2004年
5 张琼;苏云金芽胞杆菌蛋白Aii及其对植物病原菌致病性的影响[D];华中农业大学;2001年
6 张利莉;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1D的表达调控[D];华中农业大学;2000年
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8 吴岚;苏云金芽胞杆菌解离载体的构建及其特性[D];华中农业大学;2000年
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2 苏俊平;苏云金芽胞杆菌的分离鉴定及高毒力菌株的研究[D];河北农业大学;2012年
3 张喆;苏云金芽胞杆菌赖氨酸代谢基因簇表达与调控的研究[D];中国农业科学院;2014年
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5 舒正玉;重组苏云金芽胞杆菌WG-001环境安全性分析[D];华中农业大学;2003年
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