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苏云金芽胞杆菌高频转化系统的建立及其性能

李林  
【摘要】: 本研究通过筛选苏云金芽胞杆菌受体菌和对受体菌电脉冲转化条件的研究,建立了一种苏云金芽胞杆菌的高频转化系统。分别用溴化乙锭诱变处理、逐级升温培养以及用SDS处理等三种方法对苏云金芽胞杆菌无晶体(Cry~-)和无质粒突变株进行了筛选研究。用限量培养基和42℃培养9株野生菌株,结果筛选到9株Cry~-突变株;继续升温至44℃来培养其中的三个Cry~-突变株,得到内生质粒被进一步消除的突变株。然后进一步升温至46℃来培养突变株BMB170,并用SDS处理,最终筛选到1株无内生质粒的突变株BMB171。对出发菌株YBT-1463和其无质粒突变株BMB171的部分形态、生理生化和遗传学特性进行的比较研究的结果表明,突变株BMB171不形成伴胞晶体,但在个体形态与菌落特征、对红霉素等10种抗生素的敏感性、对葡萄糖等19种碳源和谷氨酸等12种氮源的利用能力及生长性能与出发菌株YBT-1463无明显差异。用pHT3101等5种供体质粒电转化BMB171的效率比电转化YBT-1463的效率显著提高,而转化导入的3种外源质粒在BMB171中的稳定性也明显高于出发菌株YBT-1463。 对用电脉冲法转化苏云金芽胞杆菌受体菌BMB171优化条件的研究结果表明,采用SG溶液作电脉冲缓冲液,用10.0 kV/cm的脉冲场强和1次电脉冲(4.6ms),以及采用对数前期(OD_(650)约0.2~0.3)收获的受体菌,可以达到最高转化频率。转化频率随质粒pHT3101浓度的增加,在54.69pg/mL至3.50μg/mL范围内呈线性增加,随后达到饱和。 通过将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Aal、cry1Ac10和cry1Ca转移至不同质粒载体上,分别构建了重组质粒pBMB121L、pBMB9821L和pBMB986L,并分别导入无质粒突变株BMB171,筛选得到携带相应ICPs基因的重组菌株。 研究了苏云金芽胞杆菌Cry~-突变株和无质粒突变株BMB171的转化性能和表达性能。用pHT3101、pBMB3305、pBMB1736、pBMB671、pBTL-1和pHV1249等6种外源质粒电转化无质粒突变株BMB171的转化频率,分别是Bt-4Q7、Bt-4D10和Bti.IPS.78/11等3种常用受体菌相应最高转化频率的2~3500倍。无质粒突变株BMB171表达cry1Ac基因的表达量高于Bt-407,略低于Bt-4D10和Bti.IPS.78/11,而表达cry1Ca和cry3Aa的表达量高于这3种对照受体菌。对小菜蛾3龄幼虫和甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力测定结果表明,BMB171表达cry1Ac基因的杀虫毒力高于Bt-4Q7和Bt-4D10,略低于Bti.IPS.78/11;而BMB171表达cry1Ca基因的毒力高于这3种受体菌。 对转座子mini-Yn10在苏云金芽胞杆菌野生菌株YBT-1463及其无质粒突变株BMB171中的转座作用进行了初步研究。


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