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《华中农业大学》 2000年
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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1D的表达调控

张利莉  
【摘要】: 苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种菌株HD-133含有代表性的三种cry1类基因cry1Ab,cry1C和cry1D,它们的表达量却明显不同。本文以基因cry1Ab为对照,进行了基因cry1D表达调控的研究,以揭示cry1D表达量低的原因。 1.Northem杂交检测了菌株HD-133中基因cry1D和cry1Ab的mRNA含量及其稳定性。结果表明:基因cry1D mRNA的形成比基因cry1Ab的mRNA滞后3小时,且基因cry1D形成mRNA的量很低,产生过程很平稳,在芽胞形成中期比cry1AbmRNA低3.7倍;cry1Ab mRNA含量在芽胞形成前期高于后期,在后期仍能大量持续稳定地转录。尽管cry1D mRNA比cry1Ab mRNA的半衰期更长,但cry1D和cry1Ab转录时间和转录量的差异是导致其表达量差异的重要原因。这一结果在国内外尚未见报道。 2.利用PCR扩增了基因cry1D启动子及上游区,在测序的基础上构建了含cry1D-lacZ融合基因穿梭质粒,将它导入不同遗传背景的苏云金芽胞杆菌菌株中并测定β-半乳糖苷酶活性,以检测cry1D启动子及上游区的作用。结果表明,在不同遗传背景的菌株中,cry1D-lacZ和cry1Ab-lacZ融合基因的表达完全不同,表明同一基因在不同菌株中转录调控不同,也许一些宿主专一性的因子参与了转录调控;而在同一菌株中cry1D-lacZ和cry1Ab-lacZ的表达差异是由于上游区的不同以及竞争有限的σ因子所致。尤其是衍生菌株HD-133-5(丢失了含cry1Ab质粒)cry1D-lacZ比cry1Ab-lacZ表达量高,这与出发菌株HD-133的Northern分析不符,可能在菌株HD-133中Cry1Ab作为正调控因子调控cry1Ab的表达。国内外尚无此方面的报道。 3.检测了翻译起始效率对cry1D表达的影响。分析cry1D基因的SD序列,发现与已报道的其它cry基因的SD序列不同。利用PCR定点诱变技术突变其SD序列GGGGA为GGAGG后,cry1D-lacZ融合基因的表达提高了1.0-1.6倍。表明GGAGG同样是苏云金芽胞杆菌最有效的SD序列,同时也揭示了基因cry1D表达量低的原因之一是不合适的SD序列而导致较低的翻译起始效率。 4.检测了在苏云金芽胞杆菌不同菌株中,不同碳源对cry1D-lacZ融合基因表达的影响。首次报道了cry1D-lacZ在同一菌株中的表达因碳源不同而异,在碳源相同的条件下不同菌株的表达也不相同,而衍生菌株HD-133-5的代谢途径非常特殊。琥珀酸钠作碳源时导致芽胞形成提前,cry1D-lacZ融合基因表达也随之提前。而以乙酸钠作碳源时,在不同亚种的菌株中都能高水平、持续稳定地表达。对苏云金芽胞杆菌制剂的发酵具有一定的指导意义。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:Q786

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