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《华中农业大学》 2001年
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猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究

王祥  
【摘要】: 乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus,JEV)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。本病对人类危害巨大,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一;对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。猪是本病毒的扩增宿主,带毒猪是本病的主要传染源。因此,防制猪患乙脑不但可以减少养猪业的损失,而且也是防止人患乙脑的重要措施。本研究着眼于猪乙脑快速诊断方法和疫苗的开发利用,主要工作包括: 1.减毒活疫苗的研究 选用原代金黄地鼠肾(PHK)细胞作为培养基质,JEV SA14-14-2毒株为生产用疫苗毒株进行疫苗研制。测定表明SA14-14-2毒株能在PHK细胞上进行稳定增殖,且有较高的滴度(≥10~(-7.2TCID_(50)/1.0mL)。采用蔗糖明胶作为冻干保护剂,冻干后毒价≥10~(-6.8)TCID_(50)/1.0mL。 疫苗原液接种血清学阴性小白鼠和妊娠母猪,小鼠无死亡和异常反应,怀孕母猪无流产和产死胎、木乃伊胎,均正常分娩,胎儿发育正常,说明疫苗是安全的。 免疫原性测定说明,该疫苗能引起小鼠产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答;40日龄仔猪免疫后可产生JEV特异性抗体。 疫苗在4-8℃和.20℃可保存一年半。 综上,该疫苗安全,免疫原性好,且便于大规模生产。 2.滴金免疫法(DIGFA)的建立与应用 将浓缩的JEV抗原吸附到硝酸纤维素膜上,加入JEV阳性、阴性血清和红色胶体金颗粒标记的兔抗猪IgG探针,摸索最佳工作条件,结果表明硝酸纤维素膜上最佳抗原吸附浓度为0.147mg/mL,最佳探针浓度为1∶20,最佳封闭浓度为5%BSA。用该法与HI试验对比检测54份送检猪血清,两法总符合率为81.4%,阳性符合率为71.4%,阴性符合率为65%,其敏感性比HI高,整个过程可在数分钟内完成。 因此,DIGFA具有快速、简便、敏感、特异的特点,可用于实验室和现场JEV抗体的检测。 3.prM、E和NS1基因片段的克隆表达与基因免疫 从自行研制的乙脑减毒活疫苗中提取JEV基因组RNA,合成3对引物,以一步法RT-PCR技术扩增获得了3个主要免疫原性基因片段的编码序列,大小分别为prM(558bp)、E(615bp)、NS1(1146bp),其中prM和NS1为全基因,E为前1/3(N端)片段。以pMD18-T为克隆载体,得到3个克隆质粒pTprM、pTE、pTNS1。构建3个基因的原核表达载体,实现了NS1基因在BL21(DE3)菌株中的高效表达,Western-blot检测表达的NS1蛋白具有生物活性。 以质粒peDNA3 .1为载体,构建3个基因的核酸疫苗质粒,均实现了在真核细 胞BHK一21中的表达,且表达产物具有生物活性。核酸疫苗质粒免疫的小鼠产生了 特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。从效果上看,三基因联合免疫最好,单基 因以NSI为好。 4. TK-/gG很51十重组病毒的构建 设计1对引物从p翎S1上亚克隆Nsl基因,将NSI基因插入到中间转移载体 pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK~NSI。将pUSK一S1与伪狂犬病毒Ea株 TK一G,/ Lacz+突变株共转染真核细胞IBRS一2,通过空斑纯化得到了乙脑病毒NSI 基因重组伪狂犬病毒TK一G水51+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NSI 蛋白。 该重组病毒可作为猪乙脑和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S852.5

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 刘学芹;应用siRNAs抑制乙型脑炎病毒复制及乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗研究[D];华中农业大学;2006年
2 李么明;乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D];华中农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
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2 孙圣福;日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D];华中农业大学;2004年
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4 吕晓丽;猪乙脑病毒RT-PCR、荧光定量PCR及多重RT-PCR诊断方法建立[D];河南农业大学;2008年
5 崔光辉;河南省猪乙型脑炎血清流行病学调查及乙型脑炎病毒河南地方株的分离鉴定[D];河南农业大学;2009年
6 陈海涛;猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测方法的建立与应用[D];华中农业大学;2009年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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5 东野传现;史玉颖;黄中利;刘玉山;亓丽红;傅剑;;“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染新城疫病毒临床效果的研究[J];山东农业科学;2007年02期
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10 沈咏舟,沈乐平,程建整;鸡传染性法氏囊病病毒冻干保护剂热稳定性研究[J];安徽农业科学;2004年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 庄金秋;梅建国;沈志强;;犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 陈宗艳;朱英奇;李传峰;李露;付玉志;王超;刘光清;;新发鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
5 王珊;刘冰;李德朋;孙远;马勇;田秀丽;宋宇;王承宇;张乃生;;马蹄香治疗犬细小病毒性肠炎的疗效观察[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(下册)[C];2011年
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7 程晶;荫硕焱;盖新娜;郭鑫;杨汉春;;2006—2008年我国部分地区规模化猪场PRV血清流行病学调查[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
8 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
9 周正新;;生脉片对IL-1介导体外培养软骨细胞凋亡的影响[A];中医药理论与应用研究——安徽中医药继承与创新博士科技论坛论文集[C];2008年
10 苟艳子;连建奇;聂青和;庄严;刘清泉;邵彬;;肝硬化患者外周血单核细胞表面TLR4、TLR2表达及临床意义[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(下册)[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王冰;EB病毒潜伏膜蛋白2A特异性CTL表位筛选及免疫功能研究[D];南京医科大学;2009年
2 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
3 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
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5 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
6 郭宪;抑制素基因工程疫苗的研究与应用[D];甘肃农业大学;2010年
7 王燕;两株海洋病原菌的分离鉴定、致病机理研究及三株海洋新菌的分类鉴定[D];中国海洋大学;2010年
8 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
9 高轩;小麦抗冻蛋白基因的分离与遗传转化研究[D];华中科技大学;2010年
10 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周晓芬;金黄色葡萄球菌肠毒素B作为免疫佐剂的研究[D];华中农业大学;2010年
2 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
3 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
4 何永龙;猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎三联灭活疫苗的研制[D];华中农业大学;2010年
5 黄刚;PPV-JEV二联灭活苗和PPV-PRV二联灭活苗的研制[D];华中农业大学;2010年
6 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
7 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
8 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
9 闫娜利;化学发光酶免疫分析法测定磺胺对甲氧嘧啶[D];郑州大学;2010年
10 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 夏启玉;肖苏生;邓柳红;易小平;张春发;;包涵体蛋白的复性研究进展[J];安徽农业科学;2008年14期
2 俞永新,张国铭,郑铮;流行性乙型脑炎(乙脑)活疫苗和灭活疫苗对不同乙脑毒株的免疫性[J];病毒学报;1989年02期
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7 张健慧,Jens Wild,Kurt Bieler,Marcus Graf,Ludwig Deml,Hans Wolf,PeterLiljestrm,Ralf Wagner,邵一鸣;传统DNA疫苗载体与Semliki森林病毒复制子对HIV-1 Pr55~(gag)表达与体液免疫原性的比较性研究[J];病毒学报;2002年01期
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9 邓瑶,孟昕,许洪林,王世峰,陆柔剑,王文玲,谷淑燕,阮力;Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较[J];病毒学报;2002年04期
10 王文玲,陆柔剑,陆振华,王世峰,付士红,邓瑶,李仁清,辛伟,梁国栋,阮力;流行性乙型脑炎病毒GSS株prM、E和NS1蛋白基因的克隆及在非复制型痘苗病毒中的表达[J];病毒学报;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 赵俊龙;猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究[D];华中农业大学;2001年
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4 李自力;猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2004年
5 徐高原;猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2005年
6 刘学芹;应用siRNAs抑制乙型脑炎病毒复制及乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗研究[D];华中农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前9条
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中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 秦毅斌;赵武;何苹萍;李茂宁;梁家幸;何颖;卢冰霞;李斌;肖爱欢;刘芳;苏乾莲;梁保忠;覃勇;张伟;韦建华;曹国敏;黄伟坚;;广西猪羊乙型脑炎血清流行病学调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
2 张丹;鲁会军;金扩世;金宁一;谭磊;刘昊;刘燕瑜;;东北地区猪流行性乙型脑炎血清流行病学调查与分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
3 张丹;鲁会军;金扩世;刘昊;谭磊;刘存霞;刘燕瑜;;猪乙型脑炎病毒E蛋白基因的分段克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(上册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 李芳;以磁珠为载体的电化学免疫传感器[D];华中科技大学;2012年
2 王(韦华);猪源乙型脑炎病毒SXBJ07株全长基因组克隆分析及ELISA检测方法的建立[D];西北农林科技大学;2009年
3 李么明;乙型脑炎病毒与树突状细胞的互作研究[D];华中农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 吴兵;斑点叉尾鮰病毒单克隆抗体及血清免疫球蛋白多克隆抗体的制备及初步应用[D];华中农业大学;2011年
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【二级参考文献】
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10 汪美先;甄桂芳;孙纪彰;;流行性乙型腦炎鼠腦疫苗人体免疫效力的研究[J];微生物学报;1956年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李伟;贾丽丽;沈连忠;李萍萍;齐卫红;李珊珊;郎书惠;杨艳伟;王超;李欣;张琳;李保文;徐洪山;李波;;减毒活疫苗的猴体神经毒力学研究[A];中国毒理学会第三届中青年学者科技论坛暨2011年全国前列腺药理毒理学研讨会论文集[C];2011年
2 储艳;陆玉忠;陶红;王标;王琰;王树巧;秦洁;徐闻青;;国产麻腮风联合减毒活疫苗安全性和免疫原性观察[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
3 吕文利;程晓毅;赵新华;田小凤;张波;;纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗的研究[A];廿一世纪微生物学发展前沿与应用新技术研讨会论文摘要集[C];2003年
4 黄育华;盛国光;张建军;;海珠益肝胶囊的抗乙型肝炎病毒作用疗效观察[A];2002全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2002年
5 刘建容;;对乙型肝炎患者的心理护理及健康教育[A];全国传染病护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2004年
6 李晓鸥;过建春;张松平;;慢性重型病毒性肝炎患者外周血淋巴细胞亚群的测定及其意义[A];浙江省免疫学会第五次学术研讨会论文汇编[C];2004年
7 屈振亮;崔乃强;吴咸中;秦明放;孔棣;周振理;;胆管癌患者合并肝炎病毒感染的回顾性研究[A];第九届全国中西医结合普通外科学术交流大会暨胆道胰腺疾病新进展学习班论文汇编[C];2005年
8 张昕;聂为民;秦恩强;周志平;张新伟;赵鹏;叶文华;范荣;赵敏;;阿德福韦酯片治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎的临床研究[A];全国第2届中西医结合传染病学术会议暨国家中医药管理局第1届传染病协作组会议论文汇编[C];2008年
9 崔建军;蒋小玲;许成;何清;谢成渝;范平;;聚乙二醇干扰素α-2a治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎研究[A];第一次全国中西医结合传染病学术会议论文汇编[C];2006年
10 张晓刚;吕志平;;慢性乙型肝炎隐证型可能是肝郁脾虚证的前期阶段[A];中华中医药学会第十三届内科肝胆病学术会议论文汇编[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李明明;现代疫苗有啥作用[N];医药养生保健报;2007年
2 山东省农科院 秦卓明 王友令;采用的疫苗一定要种属专用[N];中国畜牧兽医报;2007年
3 穆车;卫生部:脊灰减毒活疫苗安全有效[N];大众科技报;2006年
4 记者 刘垠;我国脊灰减毒活疫苗安全有效[N];大众科技报;2006年
5 北京生物制品研究所研究员 卫生部免疫规划专家委员会委员 迮文远;我国脊灰糖丸很安全[N];健康报;2007年
6 本版编辑 记者 谢绮珊 黎蘅;我国脊灰减毒活疫苗安全有效[N];广州日报;2006年
7 朱玉;脊灰减毒活疫苗实践证明安全有效[N];新华每日电讯;2006年
8 本报记者  刘景峰;『糖丸』并不总是『甜』的[N];医药经济报;2006年
9 向文;脊灰减毒活疫苗安全有效[N];科技日报;2006年
10 实习生 李阳;让儿童远离麻疹侵害[N];大同日报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王祥;猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究[D];华中农业大学;2001年
2 姜春来;细胞因子对HIV-1疫苗DNA prime/MVA boost的加强作用[D];吉林大学;2005年
3 郑浩;利用杆状病毒表达感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究[D];中国农业科学院;2009年
4 张玲;牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫促进机理初探[D];中国海洋大学;2003年
5 李自力;猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2004年
6 卫玮;大黄鱼对鳗弧菌减毒活疫苗免疫应答差异表达基因的筛选与鉴定[D];华东理工大学;2010年
7 林晨;茶尺蠖几丁质合成酶基因克隆及其双链干涉重组病毒毒力研究[D];浙江大学;2010年
8 李长贵;脊灰病毒Sabin1株疫苗载体构建及在流感通用型疫苗研制中的初步应用[D];第四军医大学;2007年
9 凌宁;截短的乙型肝炎表面抗原分子的表达及其抗原特性的研究[D];重庆医科大学;2002年
10 曹瑞源;肠道病毒71型3C~(pro)蛋白可视化重组病毒的构建与应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 颜艳;A型流感病毒冷适应减毒株拯救体系的建立[D];西北农林科技大学;2007年
2 张胜权;N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗乙肝病毒(HBV)作用[D];安徽医科大学;2001年
3 王东平;乙型肝炎病毒感染对造血干细胞移植的影响[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
4 王晓黎;乙型肝炎病毒DNA逆转录酶基因特异基因变异检测方法的建立及评价[D];河北医科大学;2003年
5 葛军辉;乙型肝炎病毒变异型s基因疫苗逆转转基因小鼠免疫耐受的研究[D];第二军医大学;2003年
6 贺启贵;门脉高压性胃病病理初步分析[D];山西医科大学;2003年
7 赵书民;乙型肝炎病毒pres_2-s基因(ayw亚型)转基因小鼠的建立[D];第二军医大学;2002年
8 杨淑丽;孕妇乙型肝炎病毒(HBV)携带者及其胎儿组织和细胞HBV标志物检测及意义[D];第三军医大学;2003年
9 王启辉;LPS_p对乙型肝炎表面抗原诱导小鼠抗体产生的影响[D];广西医科大学;2004年
10 张伟;乙型肝炎病毒前S区不同片段的克隆、鉴定及与PreS1基因相互作用蛋白在酵母双杂交系统中的筛选[D];第四军医大学;2002年
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