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苏云金芽胞杆菌抗病杀虫和广谱工程菌的构建

朱晨光  
【摘要】:本论文用cry3Aa启动子驱动表达的aiiA基因和vip83基因,通过穿梭载体电转化苏云金芽胞杆菌高毒力细胞工程菌株YBT-833-2-1和高毒力野生菌株YBT-1520,构建了一株抗植物软腐病且具杀虫活性的工程菌和一株广谱工程菌。研究了芽胞杆菌CTC菌株伴胞晶体的形态发生,观察到CTC菌株的S-层结构,证实CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体。主要结果如下: 1.苏云金芽胞杆菌抗病杀虫工程菌的构建 自身诱导物AHLs分子是病源菌数量感知系统中必不可少的成分,苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白可以降解这类信号分子,从而抑制病原菌的致病性。本研究将转录不依赖芽胞形成的苏云金芽胞杆菌cry3Aa基因的启动子替换基因aiiA自身的启动子,构建了基因pro3A-aiiA。基因pro3A-aiiA插入穿梭载体并电转化对鳞翅目害虫高毒力的细胞工程菌株YBT-833-2-1,得到工程菌BMB821A。工程菌BMB821A对自身诱导物AHLs分子的降解活性和对欧文氏菌感染植物组织的抑制能力比出发菌株大大增强,对鳞翅目害虫甜菜夜蛾的杀虫毒力LC_(50)值为3.426μL/mL,与出发菌株的LC_(50)值2.912μL/mL相比无显著差异。至今国内外尚未见有其它杀虫抗病双重活性的Bt工程菌报道。 2.苏云金芽胞杆菌广谱工程菌的构建 苏云金芽胞杆菌的营养期杀虫蛋白Vip是一种在营养期开始表达的可溶性蛋白,对小地老虎和甜菜夜蛾具有特异高毒力。用cry3Aa基因的启动子替换基因vip83自身的启动子,构建了基因pro3A-vip。基因pro3A-vip在无晶体突变株BMB171中的蛋白表达量和蛋白对小菜蛾的毒力均高于基因vip83。将pro3A-vip基因插入穿梭载体然后电转化对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株YBT-1520,得到工程菌BMB218V。工程菌表达的Vip蛋白依然为可溶性蛋白。工程菌对甜菜夜蛾的杀虫毒力比出发菌株提高了11倍,对棉铃虫则保持原有的高毒力。本研究在国内首次报道了用pro3A-vip基因构建广谱Bt程菌。通过剪接重叠PCR法,将cry1C基因中负责编码与晶体形成有关的片段与vip基因毒力核心片段融合在一起,构建了融合基因vip-1C,该基因在无晶体突变株中表达形成了90kD分子量大小的蛋白。 3.芽胞杆菌菌株CTC的S-层蛋白在细胞内可以形成伴胞晶体 芽胞杆菌菌株CTC晶体蛋白N-端序列和基因核苷酸全序列经测定发现与炭疽芽胞杆菌的S-层蛋白具有92%和87.5%的同源性,显示该菌株可能具有S-层结构。本研究结果表明菌株CTC在营养期细胞壁外可形成S-层结构,在细胞内可形成S-层的初体结构,在芽胞形成期可于细胞内形成伴胞晶体,并随芽胞的成熟而释放出来;结合氨基酸和核苷酸的序列同源性,进一步说明伴胞晶体在组成上与S-层蛋白密切相关;特别是发现当晶体蛋白基因ctc导入无晶体突变株后,可形成与菌株CTC 相似的伴胞晶体。本研究结果证实芽胞杆菌菌株CTC的伴胞晶体由S一层蛋白表达 形成。该菌株伴胞晶体成分的特殊性揭示苏云金芽胞杆菌种的鉴定原则还有待修订 和改进。


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