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《华中农业大学》 2004年
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原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析

蔡兴奎  
【摘要】:马铃薯四倍体栽培种(Solanum tuberosum L.)的遗传基础狭窄,常规的育种手段难以突破其种质范围,扩大马铃薯的基因库是加速马铃薯育种进程的关键。马铃薯野生资源具有对病虫害、霜冻、干旱和病毒等广泛的抗性,但由于倍性水平或胚乳平衡数(EBN)的差异,大多数野生种与栽培种杂交困难,限制了这些优良基因的利用。体细胞杂交技术为利用这些野生资源开辟了一条新途径,不仅可以克服远缘有性杂交不亲和的障碍,而且可以实现胞质基因的重组和转移。 青枯病(Ralstonia solanacearum)是一种重大的细菌性病害,在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生,寄主范围涉及50多个科的200多种植物,尤其易侵染马铃薯和番茄。目前,生产上对马铃薯青枯病还没有药物进行防治,综合防治措施虽可以起到一定的效果,但难以大面积推广,因此,选育抗青枯病品种无疑是最经济、有效的途径。但马铃薯栽培种没有抗源,少数具有抗性或耐性的野生种和原始栽培种又与栽培种存在杂交障碍,抗病种质资源缺乏成为马铃薯抗青枯病育种的最大障碍。本实验旨在利用体细胞杂交技术转移青枯病抗性性状,创造抗青枯病的马铃薯新种质,为马铃薯的抗病育种和倍性育种奠定基础。主要的研究结果如下: 1.建立了高效的马铃薯叶肉原生质体融合技术体系。以马铃薯栽培品种“中薯二号”经授粉诱导产生的无性系3~#、8~#(2n=4x=48)和野生种S.chacoense(2n=2x=24)的无菌苗为原生质体来源,系统研究了电融合和化学融合因素,优化了马铃薯高效融合的参数。研究表明,电融合法在交变电场(AC)100 V/cm、AC作用时间10s、直流脉冲电压(DC)1100 V/cm、DC脉冲时间60 μs、脉冲个数1次时双核融合率为4500%左右;化学融合法(PEG法)在融合诱导液(FA)作用时间15 min和固定液(FB)作用10 min条件下,其双核融合率最高为42.7%。同时比较了PEG融合和电融合两种方式对马铃薯原生质体融合效果的影响,结果显示,两种融合方式的细胞融合率和再生植株的杂种比率没有显著差异,但电融合细胞的植板率和愈伤组织分化能力均显著高于PEG融合。在本实验条件下,从四个不同的融合处理中共筛选了1212个生长旺盛的愈伤组织进行分化培养,结果有128个愈伤组织分化出芽,并发育形成完整植株,愈伤组织的平均分化频率为10.6%,不同融合处理间的愈伤组织分化频率在9.2%~16.8%之间。 2.获得了两个组合共154个体细胞杂种株系,其中略低于一半的株系为双亲的倍性之和,近90.0%的株系为单亲叶绿体类型。将首先分化形成完整植株的160个株系,经RAPD标记鉴定,表明有154个株系为真正的体细胞杂种,杂种植株的比 例为96.3%,不同融合组合的杂种率在94.4%一100%之间。进一步用流式细)Jkl仪分 析细胞杂种植株的倍性水平,结果表明,47.1%为六倍体、1 0.7%为八倍体、17.1% 为非整倍体和25.0%为混倍体。同时将叶绿体SSR引物NTCP一9用于杂种植株的叶 绿体类型检测,结果显示,大多数杂种的叶绿体并不同时具有双亲类型,89.0%的 杂种植株只含有单一亲本的叶绿体类型,其中46.1%的株系为栽培种亲本类型,42.9 %的株系为野生种亲本类型。具有双亲叶绿体类型的株系只占11.0%。实验还观察 到由同一个愈伤组织分化形成的不同植株,其倍性水平和叶绿体类型亦存在差异。 3.具有双亲叶绿体类型的体细胞杂种,在继代培养中其叶绿体类型的传递存在 分离。对两亲本的叶绿体扩增差异片段进行克隆、测序和序列比较分析,结果表明, 野生种5 chacoense的特异片段大小为242bp,与Nicotianazabacum叶绿体DNA序 列(登录号:200044.1)的10 220一10 408区段有92.4%的同源性。栽培种亲本特异 片段大小为303 bp,与Atropa beZladonna叶绿体DNA序列(登录号:AJ316582.l) 的大片段比较,有91.5%的相似性。并且与本实验克隆的差异片段具有较高同源性 的序列,均为叶绿体基因组序列,由此确定扩增片段确为马铃薯叶绿体DNA。进一 步跟踪分析具有双亲叶绿体类型的杂种植株,其叶绿体在继代培养中的稳定性,结 果表明,其叶绿体类型在继代培养过程中存在分离。 4.病原菌接种鉴定证明,约50%的体细胞杂种重组了野生种的青枯病抗性基 因。利用青枯病生理小种1号对体细胞杂种及其亲本的试管苗进行伤根接种,试验 表明,体细胞杂种株系具有从高度感病到高度抗病等一系列不同程度的抗性水平。 33个体细胞杂种株系的抗病性方差分析表明,有12.1%的株系比野生种S:hacoens。 更抗或更耐青枯菌生理小种1号菌株,39.4%的株系其抗性水平与野生种及 chacoens。没有显著差异,21 .2%的株系其抗性水平介于两融合亲本之间。另有27 .3 %的杂种株系其抗性水平与栽培种亲本没有显著差异‘进一步分析植株的抗病性水 平与其倍性水平和叶绿体类型之间的关系,结果表明,体细胞杂种植株的抗病性水 平与其倍性和叶绿体类型之间均无直接关系。 5.马铃薯体细胞杂种的遗传变异普遍存在,其变异来源于外植体的变异程度及 融合和培养过程的影响。对体细胞杂种株系的RAPD标记分析表明,相同组合的体 细胞杂种间其遗传变异普遍存在,以不同的外植体为原生质体分离材料,其杂种的 遗传
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S532

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 姚春光;两个马铃薯晚疫病水平抗性轮回群体的构建[D];华中农业大学;2010年
2 徐小勇;柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究[D];华中农业大学;2006年
3 郭鲜蒲;马铃薯体细胞杂种及其回交后代的遗传稳定性分析[D];华中农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 汪晶;二倍体马铃薯原生质体融合创制抗青枯病的新种质[D];华中农业大学;2009年
2 田伶俐;马铃薯体细胞杂种胞质遗传组成及其与青枯病抗性的关系[D];华中农业大学;2010年
3 雷婷;马铃薯青枯病抗性资源筛选与原生质体融合创制新种质[D];华中农业大学;2011年
4 李林章;二倍体马铃薯青枯病抗性的分离及分子标记鉴定[D];华中农业大学;2004年
5 高玉梅;茄子青枯病抗性的遗传规律分析及抗性基因的AFLP分子标记[D];中国农业科学院;2006年
6 黄亚玲;马铃薯原生质体遗传转化体系的构建[D];华中农业大学;2006年
7 孙雪梅;二倍体马铃薯原生质体培养与体细胞融合技术研究[D];青海大学;2007年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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5 晁祥健;孔维国;张煜;刘生祥;杨煜;李广存;;二倍体马铃薯资源现状及应用研究进展[J];山东农业科学;2008年07期
6 李路军;李世国;李娜;刘雪;;姜瘟病致病菌的研究进展[J];山东农业科学;2009年07期
7 李海鹰;蒋继志;孙海丽;;不同成分培养基影响致病疫霉生长的比较研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年09期
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9 祝进;王永清;倪彬;;尤力克柠檬小种子离体培养研究[J];安徽农业科学;2007年09期
10 董云;方彦;;我国克服油菜细胞质雄性不育系(CMS)育性不稳定的研究进展[J];安徽农业科学;2008年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 胡威;张文;黄婷;邓子牛;;利用胚抢救技术获得枸橼杂交后代[A];园艺学文集5[C];2010年
2 潘光辉;张赟;尹贤贵;杨琦凤;;番茄青枯病病原鉴定及抗病材料选育[A];重庆市园艺学会会员代表大会论文集[C];2005年
3 孙振久;王松文;刘霞;;电场条件对甘蓝与萝卜原生质体融合效果的影响[A];21世纪作物科技与生产发展学术讨论会论文集[C];2002年
4 张鹤龄;;我国马铃薯品质改良,抗真菌细菌病害基因工程进展[A];中国马铃薯学术研讨会与第五届世界马铃薯大会论文集[C];2004年
5 王蒂;张宁;司怀军;;马铃薯原生质体培养和体细胞杂交的研究[A];中国马铃薯学术研讨会与第五届世界马铃薯大会论文集[C];2004年
6 吕文河;秦昕;王凤义;陈伊里;;中国马铃薯野生种近缘栽培种利用研究进展[A];中国马铃薯学术研讨会与第五届世界马铃薯大会论文集[C];2004年
7 曹家树;;RAPD技术在蔬菜育种上的应用[A];中国园艺学会首届青年学术讨论会论文集[C];1994年
8 陈新露;赵祥云;刘建斌;李德美;;RAPD技术在园艺植物种质资源研究中的应用[A];中国园艺学会首届青年学术讨论会论文集[C];1994年
9 Nancy L.Crowe;Hak-Yoon Ju;;Variation of flavonoids and other phenolics in the leaves of Chinese plum(Prunus salicina Lind1. )cultivars[A];中国园艺学会首届青年学术讨论会论文集[C];1994年
10 王大勇;朱德蔚;连勇;戴善书;;花粉原生质体研究及其在蔬菜领域的应用潜力[A];中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论会论文集[C];1998年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王俊峰;川西獐牙菜体细胞杂交及其环烯醚萜类化合物合成相关基因香叶醇-10羟化酶的克隆和功能验证[D];山东大学;2010年
2 文亚峰;人心果品种资源亲缘关系及其授粉亲和性的研究[D];中南林业科技大学;2006年
3 杨艳丽;外源茉莉酸影响马铃薯对晚疫病抗性的初步研究[D];湖南农业大学;2010年
4 张新梅;甘蓝显性雄性不育基因Ms-cd1的精细定位[D];西北农林科技大学;2010年
5 刘缙;银杏种仁抗菌蛋白基因工程研究及小麦胚乳特异启动子的鉴定和评估[D];西北农林科技大学;2010年
6 蔡肖;青杨原生质体培养及叶片离体染色体加倍研究[D];北京林业大学;2011年
7 张晓;棉花胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组差异研究[D];中国农业科学院;2011年
8 付伟;罗汉果二倍体及四倍体遗传变异研究[D];北京协和医学院;2011年
9 陈美霞;红麻遗传连锁图谱构建及重要性状基因定位与SCAR标记的开发[D];福建农林大学;2011年
10 许忠民;甘蓝CMS451不育系的选育和利用及其不育机理研究[D];西北农林科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 罗杨;柑橘变异材料的遗传鉴定与品质分析[D];华中农业大学;2010年
2 孙源蔚;中国李‘Nubiana’愈伤组织诱导、保存及植株再生研究[D];华中农业大学;2010年
3 汪晶;二倍体马铃薯原生质体融合创制抗青枯病的新种质[D];华中农业大学;2009年
4 樊志明;萝卜甘蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究[D];华中农业大学;2010年
5 田伶俐;马铃薯体细胞杂种胞质遗传组成及其与青枯病抗性的关系[D];华中农业大学;2010年
6 王庆专;小麦骨干亲本碧蚂4号及其姊妹系遗传差异分析[D];山东农业大学;2010年
7 付希阳;小麦遗传图谱的加密和籽粒可溶性糖含量的QTL分析[D];山东农业大学;2010年
8 刘峰;适合棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选和品种鉴别[D];山东农业大学;2010年
9 任勇攀;外源RNA导入普通小麦中国春后的变异分析[D];山东农业大学;2009年
10 杨天慧;大葱、洋葱远缘杂交F_1代主要性状分析研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 江莉;祁驭矜;向凤宁;夏光敏;;马铃薯体细胞杂交的研究进展[J];山东农业科学;2006年03期
2 俞琼;徐根娣;刘鹏;;茄子抗病育种研究进展[J];安徽农业科学;2006年06期
3 李天庆 ,曹慧娟;金花茶Camellia chrysantha(Hu)Tuyama 小孢子囊、小孢子和雄配子体的发育[J];北京林业大学学报;1986年02期
4 王泽宙,邱全胜;绿色荧光蛋白基因mgfp4在水稻愈伤组织中的瞬时表达[J];北京师范大学学报(自然科学版);2000年03期
5 肖尊安,熊红;猕猴桃种间体细胞杂种细胞质DNA遗传的初步分析[J];北京师范大学学报(自然科学版);2002年05期
6 封林林,屈冬玉,冯东昕,金黎平,连勇;茄子青枯病抗性材料的鉴定及性状观察[J];长江蔬菜;2000年10期
7 王娜瑄;茄子青枯病和黄萎病的识别与防治[J];长江蔬菜;2005年04期
8 李炜,张志铭,樊慕贞;马铃薯晚疫病菌对瑞毒霉抗性的测定[J];河北农业大学学报;1998年02期
9 李炜,张志铭,李川,谷增辉;马铃薯晚疫病病菌对瑞毒霉抗性的研究[J];河北农业大学学报;1998年03期
10 朱杰华,张志铭,杨志辉;马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型的研究进展[J];河北农业大学学报;1999年04期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 梁远发;何礼远;冯兰香;唐益雄;屈贤铬;夏凤;;马铃薯抗青枯病转基因植株抗性鉴定[A];中国马铃薯学术研讨会与第五届世界马铃薯大会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝玉金;柑桔和苹果等果树种质资源的离体保存及其遗传变异[D];华中农业大学;2000年
2 朱杰华;中国马铃薯晚疫病菌群体遗传结构研究[D];河北农业大学;2004年
3 付春华;原生质体融合创造柑橘新材料及其遗传分析[D];华中农业大学;2004年
4 程运江;柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究[D];华中农业大学;2004年
5 王敏琴;柴胡体细胞杂种的异源染色体消除及片段化研究[D];山东大学;2005年
6 向凤宁;小麦远缘体细胞杂交及体细胞杂种的遗传研究[D];山东大学;2003年
7 伊华林;异源四倍体柑橘体细胞杂种有性后代遗传与变异研究[D];华中农业大学;2005年
8 陈春丽;柑橘体细胞杂种细胞遗传学及抗CTV等基因对枳的FISH分析[D];华中农业大学;2005年
9 孙玉强;棉花原生质体培养和原生质体对称融合研究[D];华中农业大学;2005年
10 李广存;马铃薯青枯病抗性相关基因的分离及其功能分析[D];中国农业科学院;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 汪晶;二倍体马铃薯原生质体融合创制抗青枯病的新种质[D];华中农业大学;2009年
2 田伶俐;马铃薯体细胞杂种胞质遗传组成及其与青枯病抗性的关系[D];华中农业大学;2010年
3 李林章;二倍体马铃薯青枯病抗性的分离及分子标记鉴定[D];华中农业大学;2004年
4 张淑红;马铃薯野生二倍体与双单倍体叶肉原生质体的培养及融合[D];甘肃农业大学;2004年
5 牛友芽;茄子雄性不育的生化分析与分子生物学研究[D];湖南大学;2005年
6 冯壮志;番茄抗青枯病生理机制及分子标记的研究[D];浙江大学;2005年
7 李竟才;以候选基因策略筛选马铃薯晚疫病水平抗性分子标记[D];华中农业大学;2006年
8 万双粉;同源四倍体和二倍体青花菜花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育比较研究[D];南京农业大学;2006年
9 高娟;柑橘体细胞杂种有性后代花粉母细胞减数分裂及花粉育性研究[D];华中农业大学;2007年
10 蒋敏华;农杆菌介导hrap基因的马铃薯遗传转化及抗病性鉴定[D];南京农业大学;2007年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 季学军;竟丽丽;马称心;孙学永;;烟草青枯病抗性的研究进展[J];安徽农业科学;2008年10期
2 韩国良;杨剑超;隋娜;;盐地碱蓬愈伤组织原生质体的分离纯化[J];山东农业科学;2012年12期
3 邢延豪;周延清;楚素霞;郭静佩;周鹏;范念斯;;CAPS标记技术及其应用进展[J];江苏农业科学;2011年05期
4 李映,蔡兴奎,李林章,谢从华;马铃薯体细胞杂种的青枯病抗性鉴定[J];中国马铃薯;2005年04期
5 雷剑;柳俊;;一个与马铃薯青枯病抗性连锁的SRAP标记筛选[J];中国马铃薯;2006年03期
6 彭邵锋;陆佳;陈永忠;王瑞;陈隆升;马力;王湘南;;木本植物原生质体培养体系研究进展[J];中国农学通报;2013年01期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 李怀志;茄子遗传连锁图谱构建及果实相关性状QTL定位[D];上海交通大学;2011年
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4 李玉珠;苜蓿与百脉根原生质体培养及体细胞杂交的研究[D];甘肃农业大学;2012年
5 郭鲜蒲;马铃薯体细胞杂种及其回交后代的遗传稳定性分析[D];华中农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
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6 雷剑;马铃薯青枯病抗性SRAP标记的筛选及蛋白酶抑制子Ⅰ基因片段的克隆[D];华中农业大学;2007年
7 徐颖;梨矮化砧木预选指标及矮化性状相关分子标记的研究[D];延边大学;2010年
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中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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4 郭文武;邓秀新;;体细胞杂交与柑橘遗传改良[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
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6 刘继红;;柑桔生物技术研究进展:原生质体融合和转基因[A];湖北省植物生理学会第十五次学术研讨会论文集[C];2007年
7 杨爱芳;陈靠山;张举仁;;利用原生质体融合的方法培育甜菜体细胞杂种[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
8 向凤宁;夏光敏;;小麦远缘体细胞杂种异源染色质鉴别及核/质基因组分析[A];中国植物生理学会第九次全国会议论文摘要汇编[C];2004年
9 孙玉强;张献龙;金双侠;梁绍光;朱龙付;聂以春;郭小平;;陆地棉Coker 201和克劳茨基棉对称体细胞杂交的研究[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
10 王桂香;刘凡;;黑芥染色体细胞学标记的建立及在体细胞杂种后代研究中的应用[A];2011全国植物生物学研讨会论文集[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 樊晓燕龙华 通讯员 潘春芳;橘香溢中华[N];湖北日报;2007年
2 陈素华 刘占洪;广泛应用于农业的生物技术[N];山东科技报;2002年
3 柴安东 张青;小麦体细胞杂交新技术育出新品种[N];江苏农业科技报;2005年
4 丁湖广;珍菇松茸的特性及人工驯化栽培技术[N];福建科技报;2006年
5 刘曙甲 刘志伟;痴心向橘走四方[N];科技日报;2007年
6 ;围绕国家目标开展科技创新[N];科技日报;2001年
7 晓华;细胞融合育种[N];山东科技报;2002年
8 ;柑桔园里探得原生质体再生植株[N];文汇报;2005年
9 刘曙甲 王景刚 刘志伟;橘香中华春满园[N];科技日报;2006年
10 记者 西林;生物医药欲为京城经济新支点[N];中国企业报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蔡兴奎;原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析[D];华中农业大学;2004年
2 孙玉强;棉花原生质体培养和原生质体对称融合研究[D];华中农业大学;2005年
3 汪静儿;棉花原生质体培养与体细胞杂交研究[D];浙江大学;2007年
4 郭鲜蒲;马铃薯体细胞杂种及其回交后代的遗传稳定性分析[D];华中农业大学;2011年
5 蔡小东;柑橘雄性不育胞质杂种创造及相关基础研究[D];华中农业大学;2006年
6 涂玉琴;药用植物菘蓝与芸薹族栽培种的族间杂种合成及遗传分析[D];华中农业大学;2009年
7 盛小光;花椰菜和大白菜新种质创制[D];南京农业大学;2009年
8 付春华;原生质体融合创造柑橘新材料及其遗传分析[D];华中农业大学;2004年
9 程运江;柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发研究[D];华中农业大学;2004年
10 江年琼;三白草和鱼腥草原生质体融合的研究[D];中南林学院;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张莉滟;双歧杆菌与乳杆菌原生质体融合的初步研究[D];重庆医科大学;2002年
2 黎永学;双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合的研究[D];重庆医科大学;2002年
3 赵炜;利用原生质体技术选育聚β羟基丁酸高产菌株和发酵条件的研究[D];西北大学;2004年
4 王令刚;棉花原生质体培养与融合[D];华中农业大学;2007年
5 丛国正;原生质体融合技术构建禽霍乱双型链依型菌株[D];甘肃农业大学;2001年
6 牛艳芳;蒙古口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种研究[D];内蒙古师范大学;2004年
7 李建洲;产碱性果胶酶菌株的原生质体融合育种[D];江南大学;2005年
8 刘娟;高产谷胱甘肽优良酵母菌种的选育及发酵条件研究[D];北京化工大学;2003年
9 张慧;缬氨酸生产菌的原生质体融合育种及发酵条件研究[D];天津科技大学;2005年
10 王春平;鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌融合菌株的构建及其双重PCR检测方法的建立[D];山东农业大学;2009年
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