猪PA28和PA700基因家族相关基因的分离、定位、SNPs检测及其与性状的关联分析

【摘要】：在过去很长一段时间里，猪育种的研究重点一直是提高瘦肉率，加快生长速度等，但是单纯追求高产使猪的抗病性降低，因为许多抗性性状和生产性状呈负相关。随着人民生活水平的提高，畜牧生产中已开始高度重视猪的健康、抗病力和猪肉品质，因为健康并充满活力的猪将大大减少用药量及猪肉的药物残留，增加市场竞争力。这就使得研究者们相继提出了从分子水平揭示疾病发生的原因，从而利用遗传学方法从遗传本质上提高动物对病原的抗性。 蛋白酶体激活因子PA28(Proteasome activator 28)和PA700(Proteasome activator 700)基因家族是一个研究热点，因为它们与MHC Ⅰ类分子介导的抗原提呈有密切关系，与机体的免疫能力直接相关。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法，克隆和定位了这两个家族的12个基因(PA28家族的2个基因和PA700家族的10个基因)，取得了如下结果： 1．结合猪EST数据库的信息和cDNA末端快速扩增(RACE)的方法，分离并鉴定了猪蛋白酶体激活因子PA28α和PA28β基因(PSME1和PSME2)的全长cDNA序列，GenBank数据库收录号分别为AF527990和AF527991。利用PCR的方法，克隆了PSME1和PSME2基因的基因组DNA全长序列并进行了序列分析，发现这两个基因有相似的基因结构，都由11个外显子和10个内含子组成。 2．用RT-PCR的方法，我们对PSME1和PSME2基因进行了组织表达谱分析。结果发现这两个基因在所检测的8个组织中均有表达，但在小肠和肾脏中的表达量相对低一些。 3．利用电脑克隆、RACE和RT-PCR的方法相结合，克隆了蛋白酶体激活因子PA700相关基因PSMC1、PSMC4和PSMC5共3个基因的全长cDNA序列，以及PSMC2和PSMD4基因的完整编码区(coding sequence，CDS)。进行了蛋白质序列的推导和功能域的预测。 4．根据猪EST数据库的已有数据，利用PCR的方法，分离了PSMC1-PSMC6和PSMD2-PSMD5共10个基因的基因组DNA片段并经测序确认。其中7个基因的序列已经提交给GenBank，获得了收录号。克隆了PSMC5基因的全长基因组DNA序列，发现该基因由12个外显子和11个内含子组成，所有的内含子和外显子的拼接位点都符合GT-AG规则。 5．用SCHP和IMpRH克隆板，对PSME1和PSME2基因进行了染色体区域定位和精细定位，结果表明这两个基因均被定位在猪7q12—q23，与T细胞受体因子α(T cell receptor alpha，TCRA)基因紧密连锁，LOD值分别为10.82和11.65。 6．用IMpRH克隆板，对PA700基因家族的10个基因进行了精细定位，结果表明，它们分布在8条不同的染色体上。PSMC1定位在7q；PSMC2定位于猪9号染 华中农业大学博士学位论文 色体;PSMC3基因定位于SsCZpl6;psMe4基因定位于sse6qlx一qxZ;PsMes和 PsMD3基因都被定位于ssc12P;PsMc6和PsMDS基因均位于猪1号染色体的长 臂;PsMDZ基因位于Ssc13q41;PsMD4荃因被定位在ssC4q21一q23。LOD值均 大于8.仇 7.对琳28的2个基因和PA7OO的10个基因共12个基因进行了SNPs的检测， 结果发现了10个可用PCR.R卫LP方法检测的SNPS，分别是PSMEI签因第8内含 子的sphl·即LP(560C一560T);pSMCZ基因第5内含子的HPall一RFLp(279G一 幻零);气PSMC3基因第3内含子的Mval·好LP(2 84G一18认);PSMCS基因第4 内含子的Tail.RFLP(639G一639C)、第3内含子的D日el·RFLP(397A一397T)和 第6外显子的Sael一RFLP(309C一309G)以及Munl.RFLP(120T一120C);PS刻吧6- 基因第5内含子的M饰卜补LP(42A一42G);PSMD3基因第10外显子的Rsal一盯LP (286G一286C);PSMD4基因第9内含子的Hin61.R卫LP(703G一703A)。在PSMDZ 基因中发现了用SSCP方法检测的多态性(10lC一10lT)。 8.对上述10个可用PCR·即LP方法检测的SNPs在二花脸、梅山猪、藏猪、 清平猪、杜洛克和大白猪中进行群体遗传学分析，卡方检验结果表明，除了PSMC6 和PSMD4基因，所有基因座的基因型频率在不同的品种中存在较大的差异。 9.在试验杂交群体(L X YT;YXLT)的上下代中检侧了这10个SNPs的遗传方 式，均呈共显性遗传方式。 10.在荷兰学者赠送的资源家系中，对Ps坷FI基因第八内含子SPhl一孙LP的 多态性与部分生产性状进行了关联分析，结果发现在不同基因型的个体中，猪断奶 重存在显著差异(P0.05)。 n.在我室与通城县畜牧局合作组建的试验群体中，采用方差分析的最小二乘 分析法，对上述SNP，(除了PSM它1基因，PSMC弓基因介il-RFLP、Dde 1.R卫LP和 P SMDZ基因)与部分生产性状(如:初生至上市平均日增重、达90kg或75kg的 日龄、屠宰率、肌肉pH值等)、部分免疫性状(如:白细胞数、红细胞数、20周 龄时血清中IgG的含量等)进行了初步的关联分析，结果发现，PSMCZ和PSMC6 基因座不同基因型个体之间的性状没有显著的差异，PSMC3基因座不同基因型个 体之间的三点平均背膘厚、红细胞数和红细胞压积存在极显著的差异(P0.01)， PSMCS基因座对猪的6一7肋间的背膘厚、三点平均膘厚、板油率和平均血细胞容 积有不同程度的影响，而PSMD3基因座不同基因型个体之间的平均血细胞容积存 在显著差异(P0.05)，PSMD4基因座不同基因型个体之间的肌肉pH值有显著的差 异(P0 .05)。

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S828