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地黄试管块根诱导及茎尖玻璃化法超低温保存

薛建平  
【摘要】:地黄(Rehmannia glutinosa L.)为玄参科多年生药用草本植物,其新鲜块根或块根的加工品作为鲜地黄、生地黄和熟地黄入药,是我国著名的“四大怀药”之一。由于在生产中长期采用块根营养繁殖,地黄易受多种病害的侵袭,其中以病毒侵害最为严重,通常田间感染率达100%,致使地黄品种退化,直接影响药农的经济效益,利用茎尖脱毒培养技术是解决地黄病毒病的最根本途径。然而脱毒苗繁殖系数小、成活率低、育苗周期长,运输极不便利,从而大大限制了其在农业生产上的推广。近年来,人们先后在试管中诱导出了半夏、马铃薯、芋等,试图尝试来替代试管脱毒苗,其中试管马铃薯的培养技术日趋成熟,完全可以替代试管苗作为种用材料,但试管地黄的研究国内外尚未见报道。另外,地黄属异花授粉植物,种子不能用来保种,生产上采用块根来留种,但同样易受气候、栽培条件及病虫害的影响,造成种质退化,甚至丢失。玻璃化冻存法是近年来发展起来的一种植物资源超低温保存方法,但地黄的低温保存研究尚未见报道。因此,本研究选用地黄“85-5”为试验材料,开展了试管地黄的诱导及茎尖玻璃化法超低温保存的初步研究。所取得的主要研究结果如下: 1.试管地黄的形成包括不定根的形成及块根膨大两个主要时期。块根的形成前提必须首先有不定根的发生,低浓度的6-BA和NAA配合使用可诱导植株产生不定根,以MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L效果较好。试验发现,在上述基本培养基中添加蔗糖能促进不定根膨大形成块根,和3%蔗糖浓度相比,在含5%和8%蔗糖的高糖培养基中,幼苗叶片深绿平展,苗不伸长,处于生长抑制状态,植株上形成白色短粗的不定根均可膨大形成试管地黄,且发育良好,说明高浓度的蔗糖对不定根膨大形成试管地黄起着至关重要的作用,本试验以5%为宜。在试管地黄的诱导过程中,不宜添加GA_3和活性炭。试管地黄诱导的最适培养条件为培养温度25℃,光照强度2000—3000lx,光照时间12h/d。 2.试管地黄的形态建成与内源生长物质的变化有关。IAA在不定根膨大初期含量呈现下降趋势,20d时开始缓慢上升。GA_3在转苗初期呈现较平稳的趋势,在25-30d时GA_3的含量迅速增长,而后则呈下降趋势,但依然处于较高水平。ABA的含量在10—20d块根膨大时呈缓慢上升趋势,20d—30d块根迅速膨大期迅速增长,30d以后含量较为平稳,较高的内源ABA含量有利于地黄块根的膨大。JA在不定根膨大初期处于较低水平,以后则一直呈缓慢的上升趋势,在试管地黄迅速膨大时期,JA在根中的含量最高,JA在地黄离体块根的形成过程中有可能起着极为重要的作用。 3.以无菌苗叶片为外植体,地黄在组织培养条件下的形态建成受内源生长物质的调控。试验观察到,在MS+6-BA2.0mg/L培养基中可直接诱导小植株的再生,这一过程中,培养初期内源IAA的含量略下降,7d后急剧增长,当不定芽形成后, I从的含量则呈现下降趋势;GA3的含量在培养1一14d呈增高趋势,14d后则急剧下 降;JA的含量整体变化幅度不明显。在MS+6一BA 1.omg/L+ NAAo.smg/L培养基 中可诱导形成试管地黄,此间IAA含量的变化与诱导植株再生的情况相反,呈快速 上升趋势;G凡的含量先明显下降,而14d后上升至刚离体的水平;JA的含量在 培养初期l一7d期间急速下降,当不定根形成时,又恢复到原先水平,14d后在不定 根膨大形成试管地黄的过程中其含量迅速增长,21d时JA含量是叶片刚离体时的近 5倍。两种培养基中叶片在l一14d培养期间,ABA的含量均下降,14d后再上升, 但是叶片在诱导植株直接再生的过程中,ABA上升和下降的幅度明显大于叶片诱导 形成试管块根时。试验结果说明,内源IAA和G凡对植株的再生起关键作用,而JA 和ABA参与了不定根的诱导及其进一步膨大形成试管块根,并且有可能起着极为重 要的作用。 4.试管地黄在形态解剖方面与自然条件下生长的地黄具有一致性,两者的成熟 结构基本上相同。在横切面上,二者都分为周皮和维管组织两部分,周皮的构成(木 栓层、栓内层、木栓形成层)基本一致,维管柱中各种组织细胞在结构或数量上均 相似。因此,试管地黄在诱导过程中其结构上未发生明显变化。。 5.建立了地黄茎尖超低温保存的技术体系。切取10mlll长的地黄脱毒苗茎尖接种 于含0.2一0.6mol/L蔗糖的MS培养基上,并添加l%一5%乙酞胺、5%DMSO;在黑暗、 10℃条件下预培养l一5d后,切取0.5一3.snun长的茎尖,用60%P VS:在25℃下装 载25min,然后用100护VSZ于0℃脱水处理10一50min,换入新鲜的PVSZ,迅速投 入液氮(LN)中,24h后取出于40℃水浴中化冻,立即用1.Zmol/L蔗糖的液体培养 基洗涤2次,每次10min,然后用氯化三苯基四氮哇(TTC)法检测成活率,或接种 于MS+6一A o.3m目1+N AA 0.02m乡飞+3%蔗糖的固体培养基上,于25℃暗培养一周 转至光下培养。结果表明,地黄茎尖超低温冻存后用TTC法检测茎尖最高成活率达 75%以上,植株再生率达50%,再生后的苗与对照没有形态上的变异。


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