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《华中农业大学》 2004年
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三种海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存研究

田永胜  
【摘要】:由于自然环境演变和人类生产活动的影响,自然水体中的鱼类有相当一部分已经濒临灭绝,保护环境,保护物种已是人类面临的一大课题。鱼类配子和胚胎超低温冷冻保存做为种质资源长期保存的技术途径之一,具有广阔的应用前景。 本课题首次将玻璃化冷冻思想引入海水鱼类胚胎冷冻保存研究,首次利用珍贵海水养殖鱼类花鲈(Lateolabrax japonicus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)不同发育阶段的胚胎做为实验材料,对海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术进行了较系统的研究。 本文首先对1,2—丙二醇、甲醇、二甲亚砜、甘油、二甲基甲酰胺、乙二醇、聚乙烯吡咯酮、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等渗透性抗剂和非渗透性抗冻剂毒性进行了研究,认为1,2—丙二醇和甲醇对鱼类胚胎的毒性较低,在玻璃化液中加入聚乙烯吡咯酮有利用于玻璃化形成和防止反玻璃化现象发生。 通过对基础液盐成分的筛选和调节,溶液渗透压和pH值的测定,胚胎在基础液中培养研究,筛选出了适合于胚胎玻璃化冷冻保存的基础液BS2。 在抗冻剂毒性分析的基础上,配制了80种不同成分和浓度的抗冻剂,通过冷冻和解冻时玻璃化形成能力,选择出了适合于花鲈胚胎冷冻保存的玻璃化液VSD2。在基础液BS2中对抗冻剂配比进行调整,经过胚胎平衡实验,筛选出了适合于牙鲆胚胎的玻璃化液PM1、PM2、PM3和PM4,适合于大菱鲆胚胎的玻璃化液PMP1。 对PM系列玻璃化液在5℃/min慢速降温过程中冰点、过冷点的产生和变化进行研究,发现浓度在41%以上的玻璃化液降温时不产生冰点结晶,而40%以下玻璃化液在慢速降温时在冰点出现了结晶。 对玻璃化冷冻和解冻过程中玻璃化液温度变化进行了研究,发现从13℃冷至—196.2℃的降温时间为15.46±1.38sec,降温速率为800℃/min;在35—45℃水浴中的解冻时间为6.67±0.49sec—7.24±0.36sec,解冻速率约在1500—2000℃/min。 对蔗糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖几种糖溶液的洗脱效果进行比较,对洗脱时 三种海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存研究 间、洗脱液浓度、洗脱方法进行筛选研究,结果显示利用o.125m。比蔗糖对玻璃化 液处理后的胚胎进行一步洗脱成活率较高,洗脱时间在15min为宜。 对花妒、牙鲜、大菱鲜三种鱼类不同时期胚胎分别在玻璃化液中的适应性进行 了研究,发现花妒尾芽胚、心跳胚和出膜前期胚对VSDZ的耐受能力较强;牙虾4 一5以肌节胚、16一加对肌节胚、尾芽胚对PM3的耐受能力较强,大菱虾4一5对 肌节胚、16一20对肌节胚、尾芽胚对PMPI的耐受能力较强,较适合于进行玻璃化 液处理和冷冻保存;并且确定了三种鱼类各时期的胚胎在玻璃化液中的适宜平衡时 间,为胚胎在玻璃化液中处理和冷冻提供了一定的参数。 通过一系列玻璃化冷冻技术的研究,对花妒、牙鲜和大菱醉的胚胎进行了冷冻 保存,首次在海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方面获得成活胚胎,并且孵化出形态正 常的鱼苗。 利用VSDZ冷冻花妒胚胎,分别在尾芽期、心跳期和出膜前期获得4粒成活胚 胎,其中1粒孵化出膜,成活率为2.17%一5.88%,成活时间为42一73h。 利用PMI一PM4和PMP分别对牙醉胚胎进行玻璃化冷冻保存,冻存时间为1 一37h,在肌节期、尾芽期、心跳期和出膜前期都获得了成活胚胎,共获得21粒冷 冻成活胚胎,其中有14粒孵化出膜,鱼苗形体正常,成活率为1.64%一32.35%,在 无饲养的条件下成活时间为14一1 08h,并且在胚胎冷冻成活上有重复性。 利用PMPI冷冻大菱醉4一5对肌节胚14h,解冻后有1粒胚胎成活,培育50h, 体长达3~。 经过本课题的研究,首次建立了海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术体系,突破 了鱼类胚胎冷冻保存的技术难关,在鱼类胚胎冷冻成活和孵化数量上取得突破性进 展,觅补了国际上在该方面研究的空白;在鱼类低温生物学研究方面具有一定的理 论意义和应用价值。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S917

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【引证文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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3 崔丽卿;稀土及稀土壳寡糖配合物对大菱鲆生长、非特异性免疫以及镉含量的影响[D];中国海洋大学;2012年
4 赵伟伟;养殖大菱鲆波豆虫的分离培养、敏感性药物分析及分子鉴定[D];中国海洋大学;2012年
5 李会英;壳寡糖稀土配合物对大菱鲆体内镉的影响[D];中国海洋大学;2011年
6 胡健;大菱鲆类胰岛素样生长因子和结合蛋白基因克隆及表达的研究[D];中国海洋大学;2012年
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