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《华中农业大学》 2004年
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肠道病毒71型基因组研究和SARS冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析

周世力  
【摘要】:本文对肠道病毒71型(SHZH03毒株)进行了全基因组序列测定,利用巴斯德毕赤酵母系统表达了肠道病毒71型外壳蛋白VP2,对SARS冠状病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(S)进行了鉴定与分析,研究结果如下: 1.肠道病毒71型(SHZH03毒株)全基因组序列测定 对肠道病毒71型(entetovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03基因组建立了覆盖全基因组的8个首尾重叠的克隆,并在此基础上对全基因组(未包括多聚腺苷酸尾)的7406个碱基进行了核苷酸序列的测定和分析。结果表明,SHZH03株基因组具有典型的肠道病毒71型的基因组结构,在编码区没有核苷酸的缺失和插入;在5'UTR和3'UTR区,SHZH03在核苷酸序列和长度上和其它EV71有差异,存在缺失和插入。核苷酸同源性比较结果表明,在P1区,SHZH03株与台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高,为87.9~92.5%;与新加坡流行株SIN5666、SIN5865以及标准株MS和BrCr的同源性则为80.4~82.3%,而与Coxsakievirus A16的同源性最低,为63.6%。氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Coxsakievirus A16的同源性最低(79.8%),但在P2和P3区,SHZH03株与Coxsakievirus A16的同源性最高(98.3%和96.8%)。P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和台湾98年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远。外壳蛋白基因VP1的遗传进化分析表明,SHZH03和SHZH98以及台湾1998年EV71流行时的8个毒株属于同一组(cluster)。这些结果提示了我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年的EV71大规模流行时的毒株,对于我国EV71的基因分型、分子流行病学研究、EV71流行规律和疾病的治疗与预防都有借鉴意义。 2.肠道病毒71型外壳蛋白VP2在巴斯德毕赤酵母中的表达 从细胞培养物中提取EV71病毒基因组RNA,再利用RT-PCR技术,扩增出EV71外壳蛋白基因VP2,连接于T载体,经测序证实目的基因VP2的序列正确;构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,经SacI酶切使之线性化,用电转化法将目的基因转化并整合到宿主菌GS115基因组中;经G418加压筛选多拷贝整合菌株、转化子表型筛选和PCR分析鉴定后以及甲醇诱导,在Pichia pastoris酵母中实现了VP2的高效分泌性表达。经饱和硫酸胺分级沉淀法初步纯化后,重组蛋白VP2的纯度可达90%以上。SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子量为27kD,与天然VP2大小相近。Western blot分析和ELISA实验表明,Pichia pastoris酵母表达的重组蛋白VP2具有免疫学活性,为研发快速、灵敏的诊断试剂和安全、高效的基因工程亚单位疫苗打下了良好的基础。 3.SARS冠状病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(s)的鉴定与分析 从广东分离了确诊为非典型肺炎死亡病例的尸解标本,利用293细胞系进行扩 增,待细胞出现典型的CPE后,收集细胞并分离病毒,利用蔗糖密度梯度超速离心 方法纯化病毒颗粒。经sDS一PAGE电泳分离,银染或考马斯亮蓝染色,在凝胶上 出现大量非常明显的条带。将所有的侯选条带从凝胶中切下,T卿sin降解,质谱(LCQ DEcAxP咖Protcomex Worksfation)分析,证实47KD左右条带为sARs一Cov病毒 颗粒的核(N)蛋白带;巧OKD:附近条带为SARS一cov病毒颗粒的s糖蛋白带。所 获得的SARs冠状病毒核蛋白的质谱分析数据覆盖了所预测病毒核蛋白氨基酸序列 的98%(第一次质谱分析数据的覆盖率为87%,第二次质谱分析数据的覆盖率为 76%)。从而首次从蛋白质水平对sARS冠状病毒核蛋白进行了证实。所获得的s蛋 白氨基酸序列的质谱分析数握占所预测S蛋白氨基酸序列的百分比较低,仅为47%, 但在我们获得的一系列二级质谱碎片的氨基酸序列与SARS一Cov基因组所预测S蛋 白质的序列完全吻合,从而在蛋白质水平对sARS冠状病毒的S蛋白及其序列进行 了证实。我们在分析S蛋白质谱数据时,发现了一些SARS冠状病毒膜蛋白(M)的 氨基酸序列,提示sARs冠状病毒存在s蛋白和M蛋白的相互作用。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R373

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 李德新,于建石,胡孔新,段淑敏,毕胜利,许文波,崔爱利,张燕,洪涛,吴昊,窦志勇,何雅慧,韩玉霞,刘刚,杜润蕾,张全福,刘琴芝,梁米芳,王建伟,郭元吉,徐红,戴淑玲,董小平,梁国栋,阮力;在传染性非典型肺炎患者组织和血液中发现冠状病毒[J];病毒学报;2003年02期
2 杨帆,金奇,何雅青,李良成,侯云德;肠道病毒71型中国分离株全基因组核苷酸序列分析[J];中国科学(C辑:生命科学);2001年02期
3 赵景民 ,周光德,孙艳玲,王松山,杨建法,毛远丽,潘登,貌盼勇,程云,王业东,辛绍杰,周先志,陆江阳,李铃,陈菊梅;1例地方非典型肺炎病例病理及病原学发现[J];解放军医学杂志;2003年05期
4 王翠娥 ,秦鄂德,甘永华,李豫川,吴小红,曹军田,于曼,司炳银,严格,李金风,祝庆余;非典型肺炎标本感染乳鼠和Vero E6细胞的病理学观察[J];解放军医学杂志;2003年05期
5 何雅青,杨帆,李良成,杨洪,陈淑霞,金奇;我国深圳地区手足口病患者肠道病毒71型的分离与鉴定[J];中华实验和临床病毒学杂志;1999年01期
6 洪涛,王健伟,孙异临,段淑敏,陈良标,屈建国,倪安平,梁国栋,任丽丽,杨仁全,郭岚,周为民,陈杰,李德新,许文波,徐红,郭元吉,戴淑玲,毕胜利,董小平,阮力;电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒[J];中华医学杂志;2003年08期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张秀美,艾武,王莉莉,宋敏训,牟建青,徐苏云,杨奎,陈溥言;鸡传染性喉气管炎的诊断与病毒分离鉴定[J];山东农业科学;1997年06期
2 张艳,李京培,明亮,李文芳;银杏叶提取物的体外抗病毒作用[J];安徽中医临床杂志;2000年03期
3 张任娜;覃志初;帅领;刘晓燕;王豪举;;鸭瘟病毒的分离与鉴定[J];安徽农学通报;2007年20期
4 张煜;苏建青;褚秀玲;成军;高丰;;水泡性口炎的发病机理与防制[J];安徽农业科学;2007年24期
5 付薇;陈磊;熊毅;潘琼;王常伟;陈进喜;胡晓静;刘棋;;O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达[J];安徽农业科学;2008年35期
6 何忠梅;宋宇;李庆杰;;千里光体外抗病毒作用研究[J];安徽农业科学;2011年32期
7 朱向秀,高聪,余寿杰,王静静,曾繁荣,罗艳,朱宏艳;血清不同稀释度检测慢性乙型肝炎血清HBeAg和HBsAg的研究[J];安徽预防医学杂志;2000年01期
8 赵月萍,马明英,王建军,谢东,任军;一起爆发型柯萨奇病毒性脑炎的病原分离与鉴定[J];安徽预防医学杂志;2001年06期
9 赵月萍,周淑洁,唐继海,罗光焘,潘福龙,夏志才,覃德芹;腮腺炎病毒抗体检测在腮腺炎并发脑膜脑炎诊断中的应用[J];安徽预防医学杂志;2003年06期
10 余荣汉;吴纳新;;温度对流行性出血热病毒点片抗原性保存的影响[J];安徽医学;1991年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;叶祥忠;李益民;;肠道病毒71抗原ELISA定量检测方法构建及其应用[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
2 何源;冯燕;;重庆市2003年乙脑疫情血清学监测分析[A];重庆市预防医学会2005年学术交流会论文集[C];2005年
3 马晓东;陈珊珊;李重九;;丙酰紫草素对烟草花叶病毒外壳蛋白的钝化作用研究初探[A];2008年全国有机质谱学术会议论文集[C];2008年
4 方美玉;任瑞文;刘建伟;;我国甲病毒的研究进展及其预防[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2009年
5 陈洪;;严重急性呼吸综合征41例临床分析[A];第十九届航天医学年会暨第二届航天护理年会论文汇编[C];2003年
6 胡秀华;何苗;;定量测定轮状病毒滴度的几种方法的优化及细胞系的选择[A];中医药生物化学与分子生物学通讯[C];2008年
7 ;Noninvasive Positive Pressure Ventilation Treatment for Acute Respiratory Failure in SARS[A];2006年中国睡眠研究会第四届学术年会论文摘要汇编[C];2006年
8 戚鹏;韩金祥;鲁艳芹;王传玺;栾中华;卜范峰;;病毒编码的miRNAs:基因表达新的调控因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
9 闫莉;孙晗笑;王峰;莫雪梅;李秀英;许华;张光;;vMIP-Ⅱ联合用药体外抗HIV-1ⅢB实验研究[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
10 刘悦越;刘艳;谷金莲;于洋;国泰;;血清抗轮状病毒IgA诊断试剂的研制[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
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1 姜淑贞;玉米赤霉烯酮对断奶仔猪的毒性初探及改性蒙脱石的脱毒效应研究[D];山东农业大学;2010年
2 姜中毅;猪传染性肝炎病毒的基因克隆及分子特征研究[D];甘肃农业大学;2009年
3 王蕾;单纯疱疹病毒Ⅰ型VP26蛋白在病毒感染过程中的分子生物学功能分析[D];北京协和医学院;2008年
4 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
5 时景伟;麻疹疫苗减毒机制及疫苗接种后我国麻疹流行病学特点的研究[D];吉林大学;2011年
6 李继庭;银翘柴桂颗粒治疗流感的临床与实验研究[D];广州中医药大学;2011年
7 茅凌翔;肠道病毒71型分子流行病学调查及miRNA抑制肠道病毒71型体外复制的研究[D];江苏大学;2011年
8 徐娟;肠道病毒EV71 VP1基因的优化和免疫原性的研究[D];南京医科大学;2011年
9 卢桂兰;北京地区人偏肺病毒全基因组序列、血清流行率分析及B细胞表位研究[D];北京协和医学院;2009年
10 管莹;与HSV-1 UL31相互作用的宿主蛋白TMEM140生物学功能研究[D];北京协和医学院;2011年
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1 郑毅;利用酵母双杂交技术研究流感病毒NS2蛋白与宿主蛋白的相互作用[D];华中农业大学;2010年
2 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
3 卢士强;甲型H1N1流感病毒NS1蛋白在大肠杆菌中的表达、抗体制备及在血清学检测中的应用[D];南京医科大学;2009年
4 张绍丽;河南省2008年手足口病病原体(EV71)分离株全基因组序列[D];郑州大学;2010年
5 于贺娟;肠道病毒71型荧光RT-PCR检测方法的建立及评价[D];郑州大学;2010年
6 殷坚;秦香颗粒对人轮状病毒致感染乳鼠血清IFN-γ、IL-2的影响研究[D];湖南中医药大学;2010年
7 樊旭成;乌鲁木齐市2007-2010年度流感病毒病原学监测分析[D];新疆医科大学;2010年
8 雷红娟;肠道病毒71型H6株在Vero细胞上的传代适应[D];河南师范大学;2010年
9 费永亮;新疆地区人群乙型肝炎病毒基因型的初步研究[D];新疆农业大学;2010年
10 齐晓亮;鸡传染性支气管炎病毒核衣壳(N)蛋白的原核表达及其抗原性分析[D];新疆农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 祝庆余,秦鄂德,王翠娥,于曼,司炳银,范宝昌,常国辉,彭文明,杨保安,姜涛,李豫川,邓永强,刘洪,甘永华;非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定[J];中国生物工程杂志;2003年04期
2 何雅青,杨帆,李良成,杨洪,陈淑霞,金奇;我国深圳地区手足口病患者肠道病毒71型的分离与鉴定[J];中华实验和临床病毒学杂志;1999年01期
3 洪涛,王健伟,孙异临,段淑敏,陈良标,屈建国,倪安平,梁国栋,任丽丽,杨仁全,郭岚,周为民,陈杰,李德新,许文波,徐红,郭元吉,戴淑玲,毕胜利,董小平,阮力;电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒[J];中华医学杂志;2003年08期
4 倪安平,林光宇,杨玲,何海英,黄崇武,刘振江,王榕生,张金山,俞建云,黎娜,廖绍荣,王家壁,杨汉英;肺炎衣原体、沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体在不同人群中的血清流行病学调查研究[J];中国人兽共患病杂志;1997年03期
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1 ;我国科学家成功解析SARS冠状病毒进化规律[J];口岸卫生控制;2004年01期
2 万佳,郝运伟,姜颖,贺福初;SARS冠状病毒的分子生物学研究[J];生命的化学;2004年05期
3 刘伟,李振勇,屈凌波;32株SARS冠状病毒基因组比对在PCR检测中的应用(英文)[J];生物信息学;2004年01期
4 谭晓东,侯炜;SARS相关的科技新术语[J];科技术语研究;2003年03期
5 张传海,王一飞,张美英,戚树源;SARS及其病原体研究进展[J];生命科学;2003年03期
6 陈志南,徐静;SARS冠状病毒的研究现状[J];第四军医大学学报;2003年11期
7 木易;SARS冠状病毒的稳定性和抵抗力[J];中华医学信息导报;2003年10期
8 晏辉钧,赵卫,方丹云,周经姣,龙北国,张文炳,郭辉玉,江丽芳;SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达[J];中国病毒学;2005年01期
9 苏山;SARS幕后的故事[J];大自然探索;2003年07期
10 石磊,张其鹏,芮伟,卢铭,景霞,尚彤,国强华;SARS冠状病毒推定结构蛋白序列分析[J];北京大学学报(医学版);2003年S1期
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1 冯金磊;王波;牛国君;郭宇;陈卫强;杨诚;饶子和;;具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的秦艽有效成分研究[A];中国化学会第28届学术年会第3分会场摘要集[C];2012年
2 何诚;朱虹;雷鸣;何君;檀华;左庭婷;杨琪;端青;;新分离人呼肠病毒和SARS-冠状病毒感染小鼠病理学变化及发病机制[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
3 朱关福;;严重急性呼吸综合征(SARS)问题的探讨[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
4 甘燕;吴少庭;秦莉;潘晖榕;戴五星;袁仕善;黄达娜;;SARS冠状病毒E蛋白DNA疫苗的构建及其实验免疫研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
5 李策生;张爱华;林连珍;李星;刘俊生;杨晓明;;有机溶剂/表面活性剂灭活血浆中的SARS冠状病毒的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
6 杨松涛;夏咸柱;乔军;高玉伟;阎芳;谢之景;赵忠鹏;黄耕;;SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达与初步应用[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
7 刘忠华;程树军;郭中敏;曲利芝;魏社林;顾为望;黄韧;;实验动物和公园动物中SARS病原来源调查初报[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
8 马超楠;徐军;;SARS冠状病毒Spike蛋白预处理对LPS介导的炎症反应的影响[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
9 王红霞;孟庆文;刘永刚;施建忠;孔宪刚;冉多良;吴东来;;SARS冠状病毒未知蛋白5的原核表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
10 潘晖榕;吴少庭;戴五星;雷明军;袁仕善;秦莉;黄达娜;张仁利;高世同;;SARS冠状病毒E蛋白的表达与纯化[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 艾启平 王怀民;科研人员发现SARS冠状病毒致命点[N];大众科技报;2009年
2 本报记者 倪永华;为攻克SARS而奋斗[N];科技日报;2003年
3 邹声文 周婷玉;非典病毒感染可能与ACE2有关[N];医药经济报;2005年
4 姜广策;SARS原凶“另有其人”[N];医药经济报;2003年
5 本报记者 谭勇;“中国干扰素之父”谈SARS软肋[N];医药经济报;2003年
6 记者 韩晓玲 通讯员 王怀民 杨雪;武大攻关SARS冠状病毒研究[N];湖北日报;2009年
7 江南;抗SARS药物找到了[N];人民日报;2005年
8 ;SARS:从未见过的冠状病毒[N];中华工商时报;2003年
9 林子;人类与病毒之战永无宁日?[N];中国商报;2003年
10 王育琨;SARS惊醒灵性的回归[N];中国经营报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周世力;肠道病毒71型基因组研究和SARS冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析[D];华中农业大学;2004年
2 王翠娥;SARS病原体鉴定、动物模型建立及灭活疫苗保护效果的病理学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 鲁小璐;SARS冠状病毒N蛋白抑制beta干扰素产生的分子机制研究[D];武汉大学;2010年
4 刘树春;SARS冠状病毒基因组及其编码结构蛋白的生物信息学研究[D];中国医科大学;2004年
5 杨宁;甲型H1N1流感病毒诱导呼吸道上皮细胞凋亡机理研究及PI4KB调控SARS冠状病毒细胞进入机理研究[D];北京协和医学院;2012年
6 赵琪;冠状病毒复制酶系结构与功能研究[D];清华大学;2010年
7 王宝梅;SARS冠状病毒S蛋白HLA-A~*0201限制性CD8~+T淋巴细胞表位的鉴定[D];第二军医大学;2004年
8 张嘉杰;SARS冠状病毒S蛋白抗原表位多肽的设计、合成及其免疫反应[D];第一军医大学;2004年
9 石嵘;SARS冠状病毒检测寡核苷酸基因芯片的研制及应用[D];第一军医大学;2004年
10 刘利锋;严重急性呼吸综合征(SARS)康复者长期的体液免疫记忆反应[D];北京协和医学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 许寅超;SARS冠状病毒N抗原蛋白表达及血清抗体检测方法研究[D];第一军医大学;2004年
2 张强;SARS冠状病毒核蛋白的原核表达及初步应用的研究[D];山西医科大学;2004年
3 胡日查;SARS冠状病毒木瓜样蛋白酶生物学功能研究[D];内蒙古农业大学;2010年
4 张玲;蝙蝠ACE2与SARS-CoV S蛋白相互作用的关键氨基酸鉴别[D];黑龙江大学;2010年
5 谢燕丕;重庆地区儿童人类冠状病毒流行情况[D];重庆医科大学;2010年
6 郑洋;SARS冠状病毒木瓜样蛋白酶对IRF3信号通路的调节机制[D];北京工业大学;2012年
7 杨宇东;SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的生物学功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
8 王晓佳;SARS冠状病毒S糖蛋白基因的克隆表达[D];吉林大学;2008年
9 栾翔凌;SARS病毒E、M、N基因克隆、表达及免疫原性初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
10 马超楠;SARS冠状病毒Spike蛋白预处理对细菌内毒素介导的肺细胞炎症反应的影响[D];广州医学院;2010年
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