基因工程菊粉内切酶毕赤酵母表达优化与菊寡糖制备研究

华承伟  

【摘要】：菊糖是一种天然的果聚糖，是植物体内的一种储藏性碳水化合物。菊糖一般由30-60个果糖单位组成，菊粉寡糖是由2-10个果糖单位组成的一种功能性的糖。近年在开发菊粉系列产品时是以菊粉寡糖这一功能成分为研究目标的，利用微生物菊粉内切酶进行菊粉寡糖的生产成为现在开发菊粉系列产品的研究热点，但大多天然微生物分泌的菊粉酶为外切酶或外切酶和内切酶的混合物，只有少数微生物产菊粉内切酶，并且其含量甚微、从而使分离纯化困难，不利于工业化生产。因此国内外关于微生物菊粉内切酶酶学性质、基因结构、工程菌株构建与生产应用方面的研究进展迅速，王建华小组已成功构建两株能高效表达菊粉内切酶的基因工程酵母，本实验利用其中一株基因工程酵母一毕赤嗜甲醇酵母(Pichia methanolica)进行高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶，并对用于指导生产实践的酶的一些特性进行了研究，利用菊苣为原料，采用现代生物技术和分析技术，对菊粉的提取和菊粉寡糖的生产进行了较深入细致的研究，这对菊粉寡糖的工业化生产具有一定的指导意义。主要结果如下： 1 菊粉内切酶基因的表达 1．1 摇瓶培养：通过不同碳源、不同诱导培养基、微量元素的浓度、菌体密度、pH值、甲醇浓度、甲醇诱导周期对酶蛋白表达的影响研究，对高密度培养的培养基进行了优化。结果表明：重组酵母对碳源利用的优先顺序为葡萄糖、果糖、甘油、甲醇和乙醇；微量元素浓度添加量为100mL／L时酵母生长良好；采用BMMY诱导培养基，菌体密度控制在OD_(600)=100，pH值在7.0左右，甲醇浓度为0.1％，诱导96h时，酶活达到最大，为35U／mL，优于INVITROGEN标准操作系统。重组酵母在此条件下的表达量是原始菌株黑曲霉9891(Aspergillus niger 9891)的10倍左右；对影响酵母生长最重要的两个因素葡萄糖和硫酸铵进行二因素二水平的正交试验，结果表明葡萄糖浓度为40g／L、硫酸铵添加量为11.5g／L时，酵母生长为最好。 1．2 高密度培养：采用三种培养基F_1、F_2、和F_3进行试验，分别测定酵母的生长曲线，都符合指数生长曲线，细胞生长延迟期分别为1.36h，2.29h，2.48h，比生长速率μ分别为0.4846h~(-1)，0.2856h~(-1)，0.2813h~(-1)。采用F_1培养基时，其优点是不产生沉淀，酵母生长速度快，培养周期短。补料-分批培养阶段采用指数补料策略，诱导方式采用葡萄糖—甲醇混合诱导和100％甲醇单一诱导相结合，培养条件控制如下：pH值6.0，DO 2004硕士学位论文 大于30%，温度30℃，甲醇浓度为0.1%左右。在菌体鲜重(Fw)为280岁L左右时连 续诱导96h，菌体不会出现自溶，酶活可达112U/mL，单位菌体鲜重酶活(U/g，FW)达 0.36单位。 2酶的特性研究表明，酶作用的最适温度为55℃，高于60℃时开始失活;其最佳pH为 5.5，在pH4.5到pH6.5时较为稳定;HgZ+、PbZ+、BaZ+对酶活具有显著抑制作用;eaZ+ 能显著提高酶活，Mg2+、Fe3+、cu2+、zn2+对酶活作用不明显;EDTA对酶活具有部分 抑制作用。酶底物研究表明，酶水解菊粉，但不水解棉子糖，水解蔗糖活性较低。 3在菊粉提取试验中，采用干菊芭粉用循环方式进行水抽提，在料液比为1:15，温度为 80℃，浸提时间为2h时提取率达98%。采用干制菊芭作为提取菊粉的原料，克服了鲜 菊芭保鲜困难的缺点，这利于工业化生产;在对总糖进行酸解法测定时，菊芭粉和菊粉 提取液中总糖的测定条件采用0.2mo呱HCI水解4Omin时，可提高测定结果准确度。 4在酶解试验中，菊粉浓度为200创L(即接近最大溶解度)时，反应30h，菊粉寡糖最 大产率为62.0%，菊粉寡糖的最大产率与酶的用量无关，但随着酶浓度的提高，菊粉寡 糖达到最大产率的时间逐渐缩短。酶用量为12U/g菊粉时，达到最大产率的时间为 20一30h，菊粉浓度为40留L时，寡聚糖达到最大产率64.6%。对产物的TLc和离子色谱 分析表明，酶解产物主要为GF:到GFI。的菊粉寡糖，产物的生成与酶解时间关系较小， 这有利于生产的控制。

【关键词】：基因工程菌株Pichia methanolica 高密度培养 菊粉内切酶 菊粉寡糖
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q78
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2004.138356
【目录】：

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