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《华中农业大学》 2004年
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盾壳霉T-DNA标记插入突变体库的构建及其质量评估

李模孝  
【摘要】:盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生真菌,在世界范围内广泛存在,是作物菌核病的一种重要生防菌。本论文对农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefacien-mediated transformation,ATMT)盾壳霉的转化条件进行了研究,并对构建的T-DNA标记插入体库进行了评价。 构建了用于转化的双元载体,即将来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC启动子替代用于转化植物的双元载体pCAMBIA1301中的CaMV 35S启动子,获得的载体pTFCM,经过热击导入农杆菌EAH105菌株用于转化。实验证明pTFCM转化盾壳霉具有较高的转化效率。 将盾壳霉分生孢子和含有质粒pTFCM的农杆菌混匀,涂在紧贴于CO-IM培养基的玻璃纸上培养2天,然后将玻璃纸转至灭菌培养皿中,用含有60μg/mL潮霉素和750 μg/mL头孢霉素的PDA覆盖在玻璃纸上,20℃培养3—5天。将选择培养基上生长出的盾壳霉菌落挑至含60μg/mL潮霉素的PDA平板上进行转化子进一步筛选。任意选取20个转化菌株提取基因组DNA,根据用于转化的载体上T-DNA标记左右边界间的Gus基因序列设计引物,应用PCR方法检测,证明转化子含有插入的T-DNA标记片段。按上述转化方法构建了含约10000个转化子的T-DNA标记插入体库。 通过对农杆菌介导转化盾壳霉条件的探索优化,发现盾壳霉在生长17天后所产生的孢子用于转化时效率明显提高;孢子浓度对转化效率影响较大,用10~8个/ml的浓度进行转化获得的转化子数量明显高于10~9个/mL和10~7个/mL孢子浓度进行转化时的转化子数量。 任意选取10个转化菌株于PDA上培养6代(无性繁殖),结果发现所有测试的转化子各子代均能在含60μg/ml潮霉素的PDA培养基上生长,而出发菌株ZS-1不能生长,说明T-DNA标记转化子在遗传上是稳定的。 为了评价转化子T-DNA插入拷贝数,任意选取58个转化子进行基因组Southern 盾壳霉T-DNA标记插入突变体库的构建及其质量评估 杂交分析,发现有48个菌株为单拷贝,4个菌株为双拷贝,另外6个菌株的实验没 有结果,表明单拷贝所占比例为823%,说明该插入体库具有较高的单拷贝比例。 从库中任意选取20个转化子与出发菌株25一1进行形态观察,测试的20个转化 子在产抱能力没有显著的改变,所有测试的转化子均能寄生菌核。 通过对库中10,000个转化子生长和菌落形态的观察,筛选获得了10个不产抱 的突变体菌株,这些不产抱突变体在生长速度和菌落形态上存在差异,其中菌株 25一IT3830与出发菌株25一1在生长速度上差异显著。 实验采用Tail一PCR技术成功地扩增出了插入体T-DNA标记两端基因组DNA的 片段。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S476

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