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《华中农业大学》 2005年
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菌核病菌诱导甘蓝型油菜抗病基因表达差异的初步分析

张成桂  
【摘要】:本实验以抗(耐)菌核病显著差异的甘蓝型油菜近等基因系(甘蓝型油菜中油821(轮回亲本)和中R888×中油821的回交5代所组成的一对近等基因系)为材料,利用cDNA-AFLP技术寻找菌核病菌诱导后所产生的表达差异,筛选并初步鉴定了与抗菌核病相关的差异片断,为油菜抗菌核病防御反应机理的研究提供线索。本实验取得的主要结果如下: 建立了用10×8.5cm小型垂直板电泳展示选择性扩增产物的体系。在43℃条件下,用小面积变性聚丙烯胺凝胶检测扩增产物,使AFLP更为简便、经济,而亦可检测到可靠、丰富的多态位点。这将推进AFLP技术更迅速进入一般实验室。 用cDNA-AFLP技术方法分析了甘蓝型油菜近等基因系受菌核病菌侵染后特异表达条带。对获得的20个差异片断进行了验证,得到9个有效片断,并克隆测序,对测序的结果进行序列相似性分析。并从中选择两条序列片断进行了分析。 由差异片段40-2的比对分析结果推测,其基因表达产物属于富含亮氨酸蛋白家族。同源片段克隆得到40-2的延伸序列片断,在近等基因系中都含有大小相同的带型。选择蛋白质延伸因子-1α作为内参照,进行半定量PCR结果显示所得序列在近等基因系之间有明显的模板量差异,即在轮回亲本中油821中表达量明显较大,在回交后代中表达量相对较少。Northern杂交的结果验证该基因片断在甘蓝型油菜抗(耐)菌核病菌材料中低水平表达,在感病材料中呈高水平表达,说明该片断与甘蓝型油菜抗(耐)菌核病有关。 对差异片断18-2进行同源片段克隆得到长度约为1260bp左右的延伸序列。ORFfinder推测该序列包含有一个完整的开放阅读框架,经BLAST序列比对分析,该片断与拟南芥中一未知功能蛋白高度同源。在进行同源性分析后发现此序列在近等基因系之间的同源性仅为89.9%;酶切位点的分析发现,MseⅠ(在进行cDNA-AFLP分析时用EcoR Ⅰ/MseⅠ限制性内切酶组合分别进行酶切近等基因系的cDNA)酶切位点发生的缺失在回交后代中,而中油821中存在此酶切位点。Northern杂交的结果却发现在回交后代中存在杂交信号,中油821没有杂交信号。引入酶切位点扩增后酶切,将酶切片断插入到表达载体中诱导表达,获得GST融合蛋白。该蛋白的功能有待于进一步研究。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S435.654

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