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《华中农业大学》 2005年
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非洲绿猴肾细胞中SARS冠状病毒受体血管紧张素转换酶2cDNA的克隆、表达及功能区的鉴定

杨国良  
【摘要】:2002年末至2003年春在世界范围爆发的非典型肺炎给人们的正常生活产生了巨大的影响,也引起了各国科研工作者的高度关注。非典型肺炎是一种急性、高度接触性的呼吸系统疾病,世界卫生组织(WHO)于2003年3月15日将其正式定名为严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)。目前已经确定,冠状病毒(coronavirus)的一个变种是引起SARS的病原体,并将其命名为SARS病毒(SARS-CoV)。SARS-CoV的细胞受体已鉴定为血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)。尽管CD209L也被认为是SARS-CoV的细胞受体,但血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV的主要功能性受体。ACE2是一种具有重要生物学功能的金属蛋白酶。本研究旨在克隆鉴定ACE2,确定ACE2的受体功能域,为进一步研究SARS-CoV与细胞的相互作用及跨种感染机制、研制抗病毒制剂等提供理论依据与实验基础。 1.SARS-CoV受体ACE2在巴斯德毕赤酵母中的表达 本研究参照人ACE2的全基因序列合成两对特异性引物,从SARS-CoV敏感细胞Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩出ACE2基因,命名为(ACE2A:102nt~1210nt ACE2B:1101nt~2524nt),然后克隆到pMD-18T中,酶切鉴定后,用SnaBⅠ和NotⅠ酶切,将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9k中,得到的重组表达载体p9K-ACE2A与p9K-ACE2B,转化GS115感受态细胞,经甲醇诱导5天表达ACE2A、ACE2B蛋白,并分泌到胞外。SDS-PAGE分析显示表达的蛋白大小约为41KD、52KD。Dot-blot结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。这对于ACE2 SARS-CoV S蛋白结合区的鉴定及SARS-CoV的临床检测都具有十分重要的意义,也为深入研究SARS-CoV与细胞受体的结合机制奠定了基础。 2.SARS-CoV受体ACE2的原核表达及其功能区的鉴定 从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩出的ACE2基因(ACE2A:102nt~1210nt ACE2B:1101nt~2524nt),前段ACE2A_(1-367)不包括ACE2的酶活性位点,后段ACE2B_(335-805)包括ACE2的酶活性位点。构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B,IPTG诱导下获得高效表达。表达的融合蛋白分子量为65KD和77KD,主要以包涵体形式存在。Western blot证实表达产物具有免疫学活性。将包涵体变性、复性后,经Western blot证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(~65KD)能与SARS-CoV S1蛋白特异结合,而pGEX-ACE2B表达的蛋白(~77KD)不能与S1蛋白结合。此结论证实ACE2的受体活性与酶活性位点无关,受体功能区在ACE2 N端335位氨基酸内。该研究是目前表达的、具有受体活性的最小ACE2片段。 3.应用噬菌体展示技术预测SARS-CoV S蛋白的功能区 本研究采用噬菌体展示(phage display)技术筛选与ACE2A(因为已经鉴定出
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
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