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《华中农业大学》 2005年
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猪瘟兔化弱毒C81/WHHV株全基因组cDNA克隆及其非结构蛋白NS2表达的研究

郭东春  
【摘要】:猪瘟(classical swine fever;CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)引起的猪的一种高度接触性和致死性传染病,以发热和出血为主要特征。猪瘟呈世界性分布,国际兽医局将其列为A类16种法定传染病之一。 参照中国猪瘟病毒兔化弱毒株的基因组序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,采用RT-PCR的方法扩增猪瘟病毒全基因组cDNA,克隆、测序,利用序列拼接软件获得猪瘟病毒C81/WHHV株基因组全长cDNA序列(GenBank:AY663656)。C81/WHHV株基因组全长12310bp,包含一个开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白前体。序列分析表明,C81/WHHV株ORF与猪瘟病毒弱毒株核苷酸序列同源性为84.4%-99.6%,氨基酸序列同源性为91.6%-99.4%。同时,比较了CSFV5’-NTR特征序列并预测了C81/WHHV株聚蛋白前体的功能域。 设计一组引物将扩增到的不同长度的NS2基因克隆至表达载体pGEX-KG中,分别构建不同重组表达质粒pKG-NS2、pKG-NS876、pKG-NS400,鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,经SDS-PAGE分析发现:只有pKG-NS400的菌体裂解产物在分子量约为40kDa处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带;Western-blot检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,该表达产物主要存在于包涵体中。而其它的菌体裂解产物没有目的蛋白表达。 将扩增到的全长NS2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pCD-NS2,经脂质体介导转染哺乳动物细胞PK-15后,间接免疫荧光检测表明:NS2蛋白初步实现了在哺乳动物细胞中的表达,表达的NS2蛋白主要在细胞膜上。这将为下一步建立稳定表达NS2蛋白的细胞系及为NS2蛋白互补试验的研究打下基础。 利用酵母密码子偏爱性,设计一对引物扩增了NS2基因,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒p9K-NS2,转入巴斯特毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE银染、Western-blot检测证实NS2未能在酵母中实现表达,这可能与酵母菌对密码子使用的偏爱性有关,虽突变了NS2基因两端的部分碱基,但基因内部的密码子对基因还是有很大的影响。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前2条
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2 朱元源;邹兴启;赵启祖;;反向遗传操作技术在猪瘟基础理论研究中的应用[J];中国兽药杂志;2011年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 朱元源;猪瘟病毒结构蛋白与生物学特性的关系[D];中国兽医药品监察所;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 聂玉春,陈建国,丁明孝;由标准强毒F114株全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒[J];科学通报;2003年10期
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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8 刘欣晏;冯卫国;吴春涛;;牛传染性鼻气管炎病的研究进展[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
9 彭军;李顺成;王树明;牛钟相;;孔雀低致病性禽流感病毒株的分离与鉴定[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
10 沈美艳;崔宝玉;牛钟相;朱瑞良;张广斌;;ELISA双抗体夹心法检测鸡传染性腺胃炎[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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4 李江南;RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究[D];吉林大学;2011年
5 艾育芳;早晚熟油菜成花机理的初步研究[D];福建农林大学;2011年
6 任艳;牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究[D];石河子大学;2010年
7 周丹;猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株核酸疫苗的研究及免疫效果比较[D];四川农业大学;2011年
8 秦雪;树鼩肝癌发生过程中的差异蛋白质组学研究及Prx家族的表达验证[D];广西医科大学;2006年
9 周斌;假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究[D];南京农业大学;2010年
10 李桂英;Serratia sp.SYBC H发酵产蛋白酶,酶学性质,应用及其基因克隆研究[D];江南大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙洪磊;整合禽网状内皮组织增生病病毒基因的鸡痘病毒分子生物学鉴定及致病机理研究[D];山东农业大学;2010年
2 高明;女贞子有效成分齐墩果酸对S180荷瘤小鼠P53蛋白表达及TNF-α的诱生作用[D];黑龙江中医药大学;2010年
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6 姜庆;比较猪瘟病毒兔化毒株和石门株5端非编码区对病毒翻译的影响[D];山东师范大学;2011年
7 王小龙;沙门氏菌invH基因亚单位疫苗和C3d分子佐剂核酸疫苗的制备与免疫效果研究[D];山东农业大学;2011年
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9 赵璐;半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis白细胞介素8免疫调节作用的研究[D];天津师范大学;2011年
10 王猛;猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白重组原及单克隆抗体的制备与鉴定[D];中国农业科学院;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前9条
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中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
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【相似文献】
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7 高博;范志强;韩乃君;张念;张锦霞;王颖;白安斌;黄红梅;扈荣良;吴健敏;;Tn5转座子介导表达猪瘟E2蛋白和EGFP重组伪狂犬病毒的构建[J];中国动物传染病学报;2011年03期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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3 本报记者 姜楠;让百姓吃到放心猪肉[N];吉林日报;2008年
4 云南省红河州开远市中和营镇畜牧兽医站 宋超 开远市动物卫生监督所 张金德;双月子猪高烧不退发病原因及防治措施[N];中国畜牧兽医报;2009年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭东春;猪瘟兔化弱毒C81/WHHV株全基因组cDNA克隆及其非结构蛋白NS2表达的研究[D];华中农业大学;2005年
2 王养会;表达猪瘟病毒石门株E0抗原重组鸡痘病毒载体的构建及免疫效果试验[D];西北农林科技大学;2007年
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4 姜庆;比较猪瘟病毒兔化毒株和石门株5端非编码区对病毒翻译的影响[D];山东师范大学;2011年
5 朱元源;猪瘟病毒结构蛋白与生物学特性的关系[D];中国兽医药品监察所;2010年
6 满朝来;猪瘟病毒HL-LY地方株E2基因在毕赤酵母中的表达及高效表达条件的探索[D];东北农业大学;2003年
7 赵志军;猪瘟病毒E2基因克隆、序列分析及最佳猪瘟免疫程序的制定[D];河北农业大学;2003年
8 朱妍;猪瘟病毒特异性单克隆抗体的研究[D];吉林农业大学;2005年
9 史子学;猪瘟荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];吉林大学;2006年
10 韦栋平;猪瘟病毒广西流行株E_2基因扩增与反应条件的优化研究[D];广西大学;2001年
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