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棉花遗传多样性研究及抗黄萎病相关基因的克隆与分析

朱龙付  
【摘要】:遗传多样性的量化与分类是收集和利用种质资源的重要前提。利用简单重复序列(SSRs)和随机扩增多态性DNAs(RAPDs)两种分子标记对来自我国各个棉区的30份陆地棉转基因种质材料进行了遗传多样性分析,材料包含有我国的现有的三种转基因类型。利用NTSYS-pc 2.10统计分析软件,采用Jaccard's相似系数UPGMA法进行聚类。结果表明三类转基因材料大致分为不同的两类,而且不同棉区的转基因材料交叉分布。相似系数分析表明,我国转基因材料的遗传多样性相对较为丰富。 同时利用这两种分子标记对31份陆地棉种质资源进行了遗传多样性分析,其中14份材料是最近从美国和伊朗引进。从有多态性的21个RAPD引物和18对SSR引物中共获得117个多态性位点。利用NTSYS-pc 2.10统计分析软件,采用Jaccard's相似系数UPGMA法进行聚类。结果表明从国内来的17份材料部分聚为一类,从国外来的14份材料大部分聚为另一类,其他材料相间排列;分别对31份材料的相似系数和来自中国的17份材料的相似系数进行了比较分析,国内材料相对于新引进的国外材料的遗传多样性水平稍高,国内和国外材料之间的遗传差异较大。这说明扩大不同地区间种质资源的交流和引进种质资源可以丰富本地材料的遗传多样性。现阶段积极引进、正确评价和有效利用种质资源仍具有重要意义。 黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae kleb.)引起的土传性真菌维管束病害,近年来在世界上对棉花和许多作物造成严重的产量和品质损失。本研究以对黄萎病有抗性的海岛棉Pima 90为材料,利用改良的异硫氰酸胍法抽提棉花根组织材料的总RNA。在幼苗接种黄萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96 h分别取幼根以抽提棉花总RNA。以未接种病原的棉花cDNA为驱动方,以接种病原的棉花cDNA为试验方,利用SSH法对接种病原后的棉花cDNA进行差减杂交以分离对抗病反应的基因。SSH文库包含534个克隆,以M13引物对扩增插入片段进行PCR扩增,电泳结果显示插入片段大小从0.2至1.2 kb不等,平均大小为0.5 kb。将克隆中的插入片段点种于尼龙膜上,分别以病原诱导前后的总cDNA为探针进行反向Northern杂交。对88个在海岛棉的抗病反应中表达有差异的克隆进行了测序并对测序结果在NCBI上利用Blastn和Blastx进行序列相似性分析。结果表明大部分阳性克隆与拟南芥、棉花等多个物种不同逆境条件下诱导的相关基因或表达序列相同或同源。鉴定到一些与抗病反应相关的基因如棉花病程蛋白家族10、拟南芥抗病反应蛋白家族、谷胱甘肽S转移酶等。同时分离到一些参与转录和信号转导的因子如MYB转录因子家族、转导蛋白家族WD-40 repeat和Cys2/His2类的锌指蛋白等。两个与植物激素调节相关基因同源的EST可能在棉花抗病反应中起作用。SSH文库的构建和分析将有助于了解棉花抗黄萎病反应的分子机制。 从SSH文库中分离到两个海岛棉受黄萎病诱导表达的基因GbPR 1和GbPR 2。GbPR 1转录本长为701碱基,包含一个528碱基的完整开放阅读框。它编码一个


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